周 瓊，郝建平，高可青，關(guān) 倩

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

十六種晉產(chǎn)北柴胡柴胡皂苷含量分析

周 瓊，郝建平*，高可青，關(guān) 倩

山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006

本實(shí)驗(yàn)分別以高效液相色譜法和分光光度法測(cè)定了山西省十三個(gè)產(chǎn)地的16種北柴胡中柴胡皂苷a、d及柴胡總皂苷的含量。結(jié)果表明，在16種晉產(chǎn)北柴胡中，柴胡皂苷a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.038%～0.369%，柴胡皂苷d的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.036%～0.681%，柴胡總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.354%～3.949%;12種晉產(chǎn)北柴胡中的柴胡皂苷a、10種中的柴胡皂苷d和13種中的柴胡總皂苷含量分別超過了0.1%、0.2%和1.0%。

北柴胡;柴胡皂苷;高效液相色譜法;分光光度法

北柴胡(Bupleurum chinense DC.)是傘形科柴胡屬多年生草本植物，也是《中國(guó)藥典》規(guī)定的柴胡正品藥材的原植物［1］。柴胡以根入藥，是常用大宗中藥材。長(zhǎng)期不合理的濫采亂挖導(dǎo)致野生北柴胡資源趨于枯竭，現(xiàn)在柴胡藥材的供應(yīng)以家種品為主。由于栽培類型種源混雜和種性退化，在北柴胡人工種植中普遍存在藥材產(chǎn)量不高、質(zhì)量均一性差和療效穩(wěn)定性不好等問題。北柴胡廣泛分布于山西省的86個(gè)縣市［2］，是山西省的道地藥材。本實(shí)驗(yàn)對(duì)采自山西省十三個(gè)主要種植、分布縣(市)的16種栽培和野生北柴胡的根進(jìn)行了皂苷含量的測(cè)定與比較，旨在為北柴胡的種質(zhì)選育提供參考依據(jù)。

1 儀器及試劑

1.1 材料來源

供試材料分別采集于山西省的長(zhǎng)治市及萬(wàn)榮、夏縣、稷山、和順、左權(quán)、陵川、平定、盂縣、交城、陽(yáng)曲、定襄、右玉等十三個(gè)縣。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀(美國(guó)Waters，Breeze色譜工作站，1525泵，2487紫外檢測(cè)器)，Hypersil ODS(150 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所)，UNICO UV-2100紫外可見分光光度計(jì)，超聲波細(xì)胞破碎儀等。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

乙腈為色譜純?cè)噭?美國(guó)天地公司)，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對(duì)照品(純度＞98.0%，上海中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究中心)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 HPLC測(cè)定柴胡皂苷a和d的含量

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Hypersil ODS-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱溫:室溫;UV檢測(cè)波長(zhǎng):250 nm;流動(dòng)相:乙腈-水(40∶60);流速:1.0 mL/min。

2.1.2 樣品溶液的制備

將每個(gè)產(chǎn)地的北柴胡根烘干后稱量0.5 g并研磨至粉末，用8%的氨水甲醇25 mL索氏提取1 h，提取3次;過濾蒸干，用甲醇定容至25 mL;取其中1 mL，加1 mL 8%的 HCl-CH3OH，30℃下反應(yīng)24 h［3］;然后加入8%KOH-CH3OH中和，甲醇定容至5 mL。

2.1.3 柴胡皂苷a和d對(duì)照品溶液的配制

精確稱取柴胡皂苷a對(duì)照品1.3 mg和柴胡皂苷d對(duì)照品1.1 mg，分別置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后定容，搖勻。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

量取0.13 mg/mL柴胡皂苷a對(duì)照品溶液10、20、30、40、50、60、70和80 μL，分別置于5 mL容量瓶中，加8%的HCl-CH3OH溶液1 mL，30℃下反應(yīng)24 h，再加8%KOH-CH3OH溶液1 mL，用甲醇定容，搖勻。分別取20 μL上述溶液注入色譜儀，按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積。以峰面積值為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷a的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程:Y=26511X-3493.7，R2=0.9944。取柴胡皂苷d對(duì)照品溶液重復(fù)上述步驟，得回歸方程Y=29527X-21843，R2=0.9946。

2.2 分光光度法測(cè)定柴胡總皂苷

2.2.1 樣品溶液的制備

稱取各樣品粗粉0.5 g，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL 2%的KOH-CH3OH，用超聲波細(xì)胞破碎儀處理30 min，冷卻，搖勻。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

量取1 mg/mL柴胡皂苷d的對(duì)照品溶液25、30、50、75、100、125和150 μL，水浴蒸發(fā)去溶媒后分別加入1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，蒸干，加85%磷酸4 mL，70℃下加熱30 min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，以545 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定吸光度。以吸光度值為縱坐標(biāo)，柴胡皂苷d的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y= 32.8X-0.0005，R2=0.9966。

3 結(jié)果與分析

3.1 柴胡皂苷a和d的含量測(cè)定

3.1.1 精密度試驗(yàn)

分別量取1.3 mg/mL柴胡皂苷a對(duì)照品溶液和1.1 mg/mL柴胡皂苷d對(duì)照品溶液各20 μL，置于5 mL容量瓶中，加8%的HCl-CH3OH溶液1 mL， 30℃下反應(yīng)24 h，再加8%KOH-CH3OH溶液1 mL，用甲醇定容，搖勻。取反應(yīng)后柴胡皂苷混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照“2.1.1”色譜條件進(jìn)行HPLC測(cè)定，重復(fù)五次，得到的柴胡皂苷a和d峰面積的RSD分別為1.95%和0.57%，結(jié)果表明精密度良好。標(biāo)準(zhǔn)品柴胡皂苷a和d的HPLC圖譜如圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品柴胡皂苷a和d的HPLC色譜圖Fig.1 The HPLC chromatogram of saikosaponin a and saikosaponin d

圖1中，峰值5.509為柴胡皂苷a標(biāo)準(zhǔn)品，峰值7.9339為柴胡皂苷d標(biāo)準(zhǔn)品。由圖1可知，采用高效液相色譜法對(duì)晉產(chǎn)不同類型的北柴胡根中柴胡皂苷a和d的含量進(jìn)行測(cè)定，目標(biāo)峰清晰穩(wěn)定，方法簡(jiǎn)便可行，可作為實(shí)驗(yàn)室測(cè)定柴胡皂苷a、d的方法［4］。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

隨機(jī)取1號(hào)樣品(見表1，下同)五份，按“2.1.2”制備樣品溶液，在0、2、4、6、8 h時(shí)進(jìn)行HPLC測(cè)定。柴胡皂苷a和d的測(cè)定結(jié)果的RSD分別為0.78%和1.46%，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)取5號(hào)樣品，精密稱取五份，按照“2.1.2”項(xiàng)制備樣品溶液，在“2.1.1”的條件下測(cè)定，柴胡皂苷a和 d的測(cè)定結(jié)果的 RSD分別為1.46%和0.97%，表明重復(fù)性良好。

3.1.4 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的北柴胡細(xì)粉，加入1 mL的柴胡皂苷d的標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算出回收率的RSD為1.47%。

3.1.5 樣品的測(cè)定

量取“2.1.2”制備的各樣品溶液20 μL，過0.45 μm濾膜，注入色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算其含量，結(jié)果見表1。

3.2 柴胡總皂苷含量測(cè)定

3.2.1 精密度試驗(yàn)

取柴胡皂苷d對(duì)照品溶液，以蒸餾水為空白，在545 nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定五次，所得RSD為1.57%，表明精密度良好。

3.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別稱取1號(hào)、11號(hào)和14號(hào)樣品，每隔10 min測(cè)定一次總皂苷，連續(xù)測(cè)量五次，并在24 h后重復(fù)進(jìn)行測(cè)量，所得RSD均小于3%，表明樣品在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

3.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

隨機(jī)取16號(hào)樣品，精密稱取五次，按照“2.1.1”項(xiàng)制備樣品溶液，以蒸餾水為空白，在545 nm處測(cè)定吸光度，所得RSD為2.06%，表明重復(fù)性良好。

3.2.4 回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的北柴胡根細(xì)粉，加入1 mL的柴胡皂苷d的標(biāo)準(zhǔn)品，按照樣品測(cè)定方法測(cè)定，計(jì)算出回收率的RSD為2.34%。

3.2.5 樣品的測(cè)定

量取“2.1.1”項(xiàng)下的樣品溶液10 mL，置蒸發(fā)皿中于水浴上蒸干，殘?jiān)诱〈硷柡偷乃?0 mL，置分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取三次，每次用量分別為20、10和10 mL，合并正丁醇層，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状既芤喝芙猓ㄈ葜?0 mL容量瓶中，搖勻。再移取此甲醇溶液0.5 mL，蒸去溶媒后加1%對(duì)二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.1 mL，蒸干，加85%磷酸4 mL，70℃下加熱30 min，冷卻至室溫，以蒸餾水為空白，在545 nm處測(cè)定吸光度，測(cè)定結(jié)果如表1。

表1 晉產(chǎn)北柴胡樣品中的柴胡皂苷含量Table 1 The content of each component in the samples ofB.chinensefrom Shanxi

按照柴胡皂苷a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.1%，柴胡皂苷d的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于0.2%，柴胡總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于1.0%質(zhì)量控制指標(biāo)的要求［4-7］，在十三個(gè)產(chǎn)地的16種樣品中，除了長(zhǎng)治老頂山、交城、交城龐泉溝和定襄北柴胡外，其余12種中的柴胡皂苷a的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均達(dá)到質(zhì)量控制指標(biāo)，其中以產(chǎn)自陵川六泉的北柴胡的含量最高，為0.369%;除了長(zhǎng)治老頂山、平定、交城、交城龐泉溝、定襄和右玉北柴胡外，其余10種中的柴胡皂苷d的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到質(zhì)量控制指標(biāo)，其中以產(chǎn)自陽(yáng)曲的北柴胡的含量最高，為0.681%;除了長(zhǎng)治老頂山、交城、交城龐泉溝北柴胡外，其余13種中柴胡總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到質(zhì)量控制指標(biāo)，其中以秋季夏縣采集的含量最高，達(dá)3.949%。由表1也可以看出，在16種樣品中，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡總皂苷三者之間不存在正比關(guān)系，柴胡皂苷a或d含量的高低必然會(huì)影響到總皂苷的含量;柴胡皂苷a含量高的類型其柴胡皂苷d的含量不一定高，反之亦然［8］。因此，不宜單獨(dú)用其中一種成分含量的高低來評(píng)價(jià)其質(zhì)量的好壞，藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)當(dāng)考慮多方面的因素。

除了一種夏縣北柴胡根采集自2010年10月外，其余15種樣品均采集于2010年5～6月。采自陵川縣六泉鄉(xiāng)、左權(quán)縣、長(zhǎng)治老頂山、定襄縣、和順縣和交城龐泉溝的6個(gè)類型為野生類型，其余10種均為兩年生栽培型。六種野生北柴胡根的生長(zhǎng)年份難以準(zhǔn)確確定，但其直徑均與10種栽培類型基本相當(dāng)。測(cè)定結(jié)果反映了各類型北柴胡根中皂苷的相對(duì)含量以及基因型的差異，可以作為優(yōu)良類型人工馴化、種植乃至種質(zhì)培育的參考指標(biāo)。

表2 晉產(chǎn)北柴胡生態(tài)環(huán)境Table 2 Environments ofB.chinensefrom Shanxi

表2為各晉產(chǎn)北柴胡產(chǎn)地的生態(tài)環(huán)境，表中數(shù)據(jù)來自當(dāng)?shù)貧庀筚Y料。綜合表1和表2結(jié)果，以柴胡皂苷a、柴胡皂苷d及柴胡總皂苷的絕對(duì)含量以及北柴胡喜稍冷晾且濕潤(rùn)的氣候與耐寒、耐旱、忌高溫、忌澇洼積水特點(diǎn)為依據(jù)［9］，參考“北柴胡適生地分析及數(shù)值區(qū)劃研究”［2］的結(jié)果，可以得出如下結(jié)論:適合晉產(chǎn)北柴胡生長(zhǎng)的地區(qū)一般地理及氣候條件為:海拔1200～1400 m，氣候以暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候?yàn)橹?，年平均降水量?50 mm左右。

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Analysis on Saikosaponin of Sixteen Bupleurum chinense from Shanxi

ZHOU Qiong，HAO Jian-ping*，GAO Ke-qing，GUAN Qian
School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China

Saikosaponins a and d were used as the chemical reference substance to establish HPLC and visible-spectrophotometry methods for determination of total contents of saikosaponin in sixteen kinds ofBupleurum chinensefrom thirteen production areas in Shanxi province.The results showed that the contents of saikosaponins a and d and the total saikosaponin inB.chinensewere 0.038% ～0.369%，0.036%～0.681%，and 0.354% ～3.949%，respectively.In addition，the contents of saikosaponin a in 12 species，saikosaponin d in 10 species，and the total saikosaponin in 13 species were more than 0.1%，0.2%and 1.0%，respectively.

Bupleurum chinenseDC.;saikosaponin;HPLC;visible-spectrophotometry

Q284.2

A

1001-6880(2012)05-0644-04

2011-04-14 接受日期:2011-08-31

山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20100311091)

*通訊作者 Tel:86-013935168866;E-mail:jphao@sxu.edu.cn