安 坤，何 靜，萬忠民，邵華武，陽小成，焦 威*

1成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，成都 610059;2中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041

不同產(chǎn)區(qū)太子參氨基酸含量測定及多元統(tǒng)計(jì)分析

安 坤1，2，何 靜1，2，萬忠民1，2，邵華武2，陽小成1*，焦 威2*

1成都理工大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，成都 610059;2中國科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041

本文采用高速氨基酸自動分析儀對太子參四大種植主產(chǎn)區(qū)(安徽、江蘇、福建、貴州)的栽培品及河南的野生品，共13個(gè)批次太子參藥材的氨基酸組成和含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示氨基酸含量基本順序?yàn)?精氨酸(Arg)＞谷氨酸(Glu)＞天冬氨酸(Asp)＞脯氨酸(Pro)，其中安徽宣城產(chǎn)太子參樣品(S2)的16種氨基酸總含量和7種人體必需氨基酸含量最高。以上述4種主要氨基酸作為指標(biāo)，探討了不同產(chǎn)區(qū)太子參藥材的內(nèi)在品質(zhì)。采用聚類分析法對氨基酸含量進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，表明氨基酸含量分析可體現(xiàn)樣品產(chǎn)區(qū)間和產(chǎn)區(qū)內(nèi)的差異性，可區(qū)別野生品與栽培品。這些結(jié)果為發(fā)展太子參道地藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供了依據(jù)。

太子參;氨基酸;聚類分析

太子參為傳統(tǒng)清補(bǔ)中藥，別名孩兒參、童參、四葉參、米參等，系石竹科植物孩兒參(Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax)的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺等功效。臨床用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴、肺燥干咳等癥狀［1］。在我國，太子參分布于華東、華中、華北、東北和西北等地。現(xiàn)市售太子參主要來自于安徽、江蘇、福建、貴州四大種植基地。研究表明，太子參中含有環(huán)肽、氨基酸、多糖等化學(xué)成分［2］。其中，太子參富含的氨基酸是太子參滋補(bǔ)功能的重要藥用成分，與它的補(bǔ)益功效有著非常密切的關(guān)系［3］。因此太子參氨基酸的組成及其含量應(yīng)作為太子參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的一個(gè)重要指標(biāo)。但是，在藥典中并未提及氨基酸含量測定及其分析標(biāo)準(zhǔn)。

國內(nèi)對太子參的氨基酸含量測定曾有一些報(bào)道。余國奠等從南京紫金山野生太子參中檢測出14種氨基酸［4］。鐘方曉對山東產(chǎn)區(qū)栽培與野生太子參樣品的研究表明，各樣品的總氨基酸含量差異不大［5］。李仕海等對江蘇溧陽栽培品和南京紫金山野生品進(jìn)行分析，江蘇產(chǎn)太子參總氨基酸含量較高［6］。張麗麗等人對比貴州和福建的栽培太子參，總氨基酸含量和人體必需氨基酸總量，前者均高于后者［7］。陳體強(qiáng)等對福建柘榮太子參氨基酸成分進(jìn)行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)精氨酸含量較高［8］。但是，這些研究的樣品收集并不全面，或僅局限于單一產(chǎn)區(qū)、單一樣品的對比和分析，也并未涉及產(chǎn)區(qū)內(nèi)太子參氨基酸組成及含量的差異性。另外，以氨基酸總含量高低作為分析指標(biāo)，忽略了重要氨基酸成分及影響因素，無法全面地評價(jià)太子參質(zhì)量優(yōu)劣。本文對采自四大產(chǎn)區(qū)及河南的不同批次太子參氨基酸進(jìn)行含量測定，分析其作為質(zhì)量評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)在聯(lián)系。通過氨基酸含量的比較，以相對含量為指標(biāo)，采用最短距離法進(jìn)行聚類，對其內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行探討，為發(fā)展太子參地道藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和材料

日立L8800全自動高速氨基酸分析儀(日本日立公司)，化學(xué)試劑均為分析純。

藥材樣品經(jīng)李芳蘭副研究員鑒定，藥材標(biāo)本保存于中國科學(xué)院成都生物研究所。樣品來源見表1。

表1 太子參樣品來源Table 1 The producing area and batch ofP.heterophylla

1.2 太子參氨基酸含量測定

1.2.1 樣品制備

將太子參樣品粉碎，過80目篩，于60°C干燥至恒重，參照GB/T18246-2000進(jìn)行常規(guī)酸水解處理。精密稱取樣品粗粉約100 mg，加6 mol/L鹽酸溶液10 mL，充入氮?dú)猓杆俜饪?，?10°C水解24 h，過濾，濃縮，加0.02 mol/L HCl溶解并定容至50 mL容量瓶，即得待測樣品溶液。

1.2.2 測試條件

HITACH IL-8800型全自動高速氨基酸分析儀，Window NT操作系統(tǒng)，分析時(shí)間為30 min。色譜柱3 μm×4.6 mm×60 mm，pH 2.2檸檬酸緩沖液流量0.4 mL/min，茚三酮流量0.3 mL/min，樣品進(jìn)樣量為20 μL。氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品均為進(jìn)口分析純品(日立公司);緩沖液及茚三酮溶液以0.45 μm微孔濾膜過濾。

1.3 分析方法

聚類分析(Cluster Analysis)是研究“物以類聚”的數(shù)理統(tǒng)計(jì)法，特別適用于樣品類別歸屬不清楚的情況。系統(tǒng)聚類是目前應(yīng)用較為廣泛的一種聚類方法，它是將一批樣品或變量，按照它們在性質(zhì)上的親疏程度分類。基本思想是首先定義個(gè)體間的距離，把個(gè)體逐步地合并成一些子集，直至整個(gè)總體在一個(gè)集合之內(nèi)為止。距離越近，說明樣本間的差異性越小，反之，距離越遠(yuǎn)，說明樣本間的差異性越大。設(shè)有n個(gè)樣品，每個(gè)樣品測定m種元素，這樣可得到一個(gè)由宏量和微量元素?cái)?shù)據(jù)組成的n行m列的矩陣，該矩陣反映了這些樣品在宏量與微量元素含量及分布上的差異，聚類分析最終使同類樣品相聚集，不同類樣品相分離開［9］。

測定不同產(chǎn)區(qū)、不同批次太子參樣品氨基酸含量，以相對含量為指標(biāo)，在聚類方法上采用最近鄰元素，歐氏距離測量，用R進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，繪出樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參氨基酸組成與含量

不同產(chǎn)區(qū)、不同批次太子參樣品的氨基酸種類和含量測定結(jié)果見表2。太子參樣品氨基酸色譜圖見圖1。從表2和圖1中可看出:各樣品均含有16種氨基酸，總氨基酸含量及人體必需氨基酸含量具有顯著的差異性。

表2 太子參樣品氨基酸組成及含量Table 2 The composition and contents of amino acids inP.heterophyllasamples

圖1 太子參樣品氨基酸色譜圖Fig.1 Chromatogram of amino acids in P.heterophylla samples

2.2 太子參氨基酸分析比較

由表2可以得出:

2.2.1 從不同產(chǎn)區(qū)、不同批次太子參樣品中分別檢測出16種重要氨基酸。其中，人體必需氨基酸7種，即異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。嬰兒必需氨基酸酸2種，即精氨酸、組氨酸，與文獻(xiàn)報(bào)道的太子參氨基酸組成一致。由于色氨酸在酸性條件下易分解，因此本實(shí)驗(yàn)不考慮色氨酸含量。

2.2.2 對13個(gè)批次太子參總氨基酸含量進(jìn)行分析比較:安徽宣城產(chǎn)太子參 S2所含總氨基酸含量最高，其含量大小排列順序?yàn)?S2、S10、S3、S12、S8、S5、S11、S7、S9、S1、S13、S4、S6。

2.2.3 對13個(gè)批次太子參人體必需氨基酸含量進(jìn)行分析比較:安徽宣城產(chǎn)太子參 S2的人體必需氨基酸含量最高，其含量大小排列順序?yàn)?S2、S3、S10、S5、S8、S12、S11、S7、S1、S9、S13、S4、S6。

2.2.4 所測定批次大部分太子參樣品氨基酸組成以精氨酸含量最高，其次是谷氨酸，第三是天冬氨酸，第四是脯氨酸。

2.2.5 精氨酸對提高機(jī)體免疫功能、改善氮平衡及促進(jìn)胰島素等多種激素分泌起重要作用。臨床上精氨酸用于治療肝昏迷［3］。其含量大小排列順序?yàn)镾2、S10、S12、S8、S5、S1、S7、S13、S11、S9、S4、S6。

2.2.6 谷氨酸可增強(qiáng)大腦功能，緩解疲勞，同時(shí)具有改進(jìn)和維護(hù)大腦機(jī)能的功效。其含量大小排列順序?yàn)?S2、S10、S12、S8、S3、S5、S11、S1、S9、S7、S13、S4、S6。2.2.7 天冬氨酸對高氨血癥、肝功能障礙、貧血等有良好的效果。其含量大小排列順序?yàn)?S2、S10、S3、S5、S8、S12、S1、S11、S7、S9、S13、S4、S6。

2.2.8 脯氨酸有助于傷口愈合，在結(jié)構(gòu)上與血紅蛋白有密切關(guān)聯(lián)。其含量大小排列順序?yàn)?S2、S3、S5、S10、S8、S12、S11、S7、S1、S9、S4、S13、S6。

2.3 氨基酸聚類分析

由圖2的聚類樹狀圖可見:不同產(chǎn)區(qū)的12個(gè)批次太子參樣品可聚為一類，S8與以上12個(gè)太子參樣品在聚類分析上相距較遠(yuǎn)，單獨(dú)為一類。河南產(chǎn)區(qū)太子參S8為野生品，其余為栽培品，栽培及野生太子參相對氨基酸含量的區(qū)別在聚類分析中得到體現(xiàn)。

栽培太子參樣品經(jīng)聚類分析后可分為如下三類:(1)S1、S7、S13、S5、S3、S4、S11、S9、S6為一類，其中S1、S13為福建產(chǎn)太子參，S5、S6、S7為貴州施秉產(chǎn)太子參，S4、S3、S11為安徽宣城產(chǎn)太子參，S9為江蘇溧陽產(chǎn)太子參;(2)S10、S12為一類，屬于江蘇句容產(chǎn)區(qū)太子參;(3)S2自成一類，為安徽宣城產(chǎn)太子參。聚類結(jié)果可將不同產(chǎn)區(qū)以及同一產(chǎn)區(qū)的不同樣品區(qū)分開，體現(xiàn)了產(chǎn)區(qū)間和產(chǎn)區(qū)內(nèi)樣品的差異性。

圖2 太子參樣品聚類樹狀圖Fig.2 Clustering dendrogram of P.heterophylla samples

3 討論

3.1 本文定量測定了13個(gè)批次太子參藥材的氨基酸組成和含量，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。其中，安徽宣城產(chǎn)太子參樣品S2的總氨基酸和人體必需氨基酸含量最高，分別為130.66 mg/g和37.036 mg/g，貴州施秉產(chǎn)太子參樣品S6的總氨基酸含量和人體必需氨基酸含量最低，分別為60.586 mg/g和21.111 mg/g。另外，氨基酸含量基本順序?yàn)?精氨酸＞谷氨酸＞天冬氨酸 ＞脯氨酸。僅S6和S11的天冬氨酸、脯氨酸含量排列次序有所不同，這主要是由于引種來源、栽培技術(shù)等因素造成的，但總體趨向相同，這一規(guī)律呈現(xiàn)一定特征性(見表2)。

3.2 本文通過以氨基酸相對含量為指標(biāo)，通過聚類分析鑒別了野生品和栽培品(見圖2)。從聚類樹狀圖可以直觀地看出，河南產(chǎn)野生太子參樣品 S8與其他栽培樣品在聚類距離上相距較遠(yuǎn)。

聚類分析體現(xiàn)了同一產(chǎn)區(qū)樣品間相似性和不同產(chǎn)區(qū)樣品的差異性(見圖2)。來源于相同產(chǎn)區(qū)樣品，S1和S13;S4和S11均相近聚類。而不同產(chǎn)區(qū)之間，聚類結(jié)果較遠(yuǎn)。貴州省牛大場的太子參品種是90年代初從福建柘榮引種的，二者親緣關(guān)系較近，這一特點(diǎn)在S5、S7、S13的聚類結(jié)果中得到體現(xiàn)。

聚類分析也體現(xiàn)了同一產(chǎn)區(qū)內(nèi)不同樣品間的差異性(見圖2)。在產(chǎn)區(qū)內(nèi)，引種來源相近，藥材的主要成分含量往往類似。但是由于種植條件以及引種后期的變化，產(chǎn)生一定差異性，但直觀較難判別。在我們的分析結(jié)果中，產(chǎn)區(qū)內(nèi)樣品的關(guān)系與種植區(qū)域遠(yuǎn)近相關(guān)。S9、S10和S12都采自江蘇產(chǎn)區(qū)，S10和S12來源于句容市，S9來源于溧陽市，這與聚類結(jié)果中S10和S12聚為一類，S9聚類相距較遠(yuǎn)一致。同理，S5、S6、S7的聚類結(jié)果也體現(xiàn)了大產(chǎn)區(qū)樣品差異和種植區(qū)域遠(yuǎn)近的關(guān)系。安徽產(chǎn)區(qū)與山東、江蘇兩大傳統(tǒng)種植區(qū)域交界，引種來源較為復(fù)雜。而且，農(nóng)戶種植的分散程度高，樣品采集多來自于分散農(nóng)戶，栽培條件多樣，不同于其他產(chǎn)區(qū)的大片規(guī)范種植區(qū)。這些特點(diǎn)是安徽宣城產(chǎn)太子參樣品(S2、S3、S4、S11)總氨基酸、人體必需氨基酸的含量差異(見表2)和聚類差異顯著的主要原因。從以上分析結(jié)果可以看出，借助多元統(tǒng)計(jì)分析方法將樣品按照藥材的氨基酸內(nèi)在規(guī)律合理地分為幾類，能夠深入研究藥材的內(nèi)在品質(zhì)。因此，氨基酸組成及含量可作為太子參道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制的參考指標(biāo)。

3.3 太子參中氨基酸組成多樣，含量豐富，參與人體多項(xiàng)生命活動，但對其氨基酸主要成分和功效之間的關(guān)系至今尚不明確，還需要多學(xué)科方法深入研究，為發(fā)展太子參藥材地道性及臨床提供道地藥材提供科學(xué)依據(jù)。

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Determination and Multivariate Statistical Analysis of Amino Acid in Pseudostellaria heterophylla from Different Producing Areas

AN Kun1，2，HE Jing1，2，WAN Zhong-min1，2，SHAO Hua-wu2，YANG Xiao-chen1*，JIAO Wei2*

1College of Material Chemistry and Chemical Technology，Chengdu Univerity of Technology，Chengdu 610059，China;2Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041，China

The contents and composition of amino acids in 13 bathes ofPseudostellaria heterpphylla(collected from Anhui，Jiangsu，F(xiàn)ujian，Guizou and Henan)were determined by HITACH IL8800 high speed amino acid analyzer.The results showed main sequence of amino acid content was arginine(Arg)＞glutamic acid(Glu)＞aspartic acid(Asp)＞proline(Pro).The total contents of 16 amino acids and essential amino acids were highest in samples collected from xuancheng(Anhui province).In order to discuss the intrinsic quality of these samples，the Arg，Glu，Asp and Pro were analyzed and compared as the quality index.In addition，the multivariate statistical method was used to analyze the differences of samples from different origins and the differences between wild and cultivated samples.These results could be used as references for the quality standard control ofP.heterpphylla.

Pseudostellaria heterophylla;amino acid;cluster analysis

R917;R927.2

A

1001-6880(2012)05-0594-05

2011-08-23 接受日期:2011-12-15

中科院西部之光博士項(xiàng)目(科發(fā)人教字〔2011〕1號);國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21002098);科技重大新藥平臺“中藥質(zhì)量系統(tǒng)評價(jià)方法、體系及技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)平臺”

*通訊作者 Tel:86-28-85248256;E-mail:jw2272001@yahoo.com.cn; yxc39@163.com