侯志慧， 王國紅， 吳春平， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003)

血液中的葡萄糖通過血腦屏障進入腦組織需要相應(yīng)的運載工具，即葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(glucose trans-port proteins，GLUT)來完成［1］。腦組織表達 GLUT1和GLUT3，GLUT1主要在微血管內(nèi)皮上表達，而神經(jīng)元則主要表達GLUT3。正常情況下，腦細胞主要依賴葡萄糖的有氧氧化獲得能量。缺氧缺血時，葡萄糖的有氧氧化受到抑制，腦細胞轉(zhuǎn)為依靠葡萄糖的無氧糖酵解來獲取能量。然而，無氧糖酵解產(chǎn)生ATP的效率下降，要滿足腦細胞對能量的需求，就需要大量葡萄糖作為底物，葡萄糖進入腦細胞必須借助細胞膜上的GLUT3進行跨膜轉(zhuǎn)運。因此GLUT3表達的多少就成為決定缺血時腦細胞對葡萄糖利用效率的首要因素，在腦缺氧缺血損傷的病理過程中起關(guān)鍵作用，是干預(yù)腦缺氧缺血損傷的重要靶點。探索缺氧缺血時增強神經(jīng)元葡萄糖供給和攝取能力的調(diào)控因素具有重要意義。本實驗室前期在缺氧缺血新生鼠和缺血－再灌注大鼠已經(jīng)證實孕酮(progesterone，PROG)對缺血腦組織有保護作用［1－2］，還觀察到孕酮可上調(diào)缺氧缺血新生鼠腦組織GLUT1和GLUT3的表達［3］。為排除體內(nèi)復(fù)雜內(nèi)環(huán)境的影響，本研究采用神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)誘導(dǎo)分化的具有典型神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能特性的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞，建立其氧糖剝奪(oxygen－glucose deprivation，OGD)損傷模型，模擬體內(nèi)腦缺氧缺血條件，進一步在體外研究孕酮抗神經(jīng)元缺氧缺血損傷的保護作用并探討其對GLUT3的干預(yù)作用。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 2－(2－甲氧基－4－硝苯基)－3－(4－硝苯基)－5－(2，4－二磺基苯)－2H－四唑單鈉鹽［2－(2－methoxy－4－nitrophenyl)－3－(4－nitrophenyl)－5－(2，4－disulfophenyl)－2H－tetrazolium sodium salt，WST－8］細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和乳酸鹽脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所;羊抗鼠GLUT3多克隆抗體購自Santa Cruz;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒A3500購自Promega;Trizol試劑和NGF 2.5S購自Invitrogen;胎牛血清購自杭州四季青公司;DMEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(無糖，無酚紅)和孕酮均購自Sigma。

1.2 細胞系 PC12細胞購于中國科學(xué)院上海生科院細胞資源中心。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組 PC12細胞采用DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清、1×105U/L氨芐青霉素和1×105U/L鏈霉素，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分為正常對照組(常規(guī)培養(yǎng)，不行 OGD處理)、OGD組(無糖培養(yǎng)基、氧濃度＜1%環(huán)境中進行OGD處理30 min后，恢復(fù)常氧常糖培養(yǎng)24 h)和PROG+OGD組(在OGD和復(fù)氧復(fù)糖期間培養(yǎng)基中含10 nmol/L孕酮，余同OGD組)。培養(yǎng)基中均不含酚紅，以避免對檢測結(jié)果的干擾。

2.2 PC12細胞的誘導(dǎo)分化 取對數(shù)生長期的PC12細胞，棄培養(yǎng)液，用PBS漂洗1次，加入預(yù)熱至37℃的0.25%胰酶1.5 mL，消化30 s，觀察細胞間有裂紋時，吸去胰酶，終止消化，加入預(yù)熱的含50 μg/L NGF 2.5S的 DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整細胞密度至1×109cells/L，傳代培養(yǎng)5 d，待PC12細胞長出較長突起，具有典型神經(jīng)元特征時，取誘導(dǎo)分化良好的PC12細胞，按實驗需要密度接種于培養(yǎng)板中，再誘導(dǎo)分化48 h，選取貼壁好，誘導(dǎo)分化一致的培養(yǎng)孔隨機按上述分組。

2.3 OGD模型的建立 參照文獻建立PC12細胞的OGD模型。取對數(shù)生長期PC12細胞，棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，用預(yù)熱無糖DMEM培養(yǎng)基漂洗2次，隨后換上預(yù)熱的無糖DMEM培養(yǎng)基和10 nmol/L孕酮無糖工作液，移去培養(yǎng)板蓋后將培養(yǎng)板放入(37.0±0.5)℃缺氧艙內(nèi)，持續(xù)充入體積分數(shù)分別為95%N2+5%CO2的混合氣體行缺氧處理。缺氧氣體由艙底進入，艙頂排出，以10 L/min的流量置換艙內(nèi)氧氣，6min后(測定艙內(nèi)O2濃度降至1%以下)再以1 L/min的流量進行OGD處理30 min。OGD結(jié)束后取出培養(yǎng)板，OGD組更換為預(yù)熱的常糖DMEM培養(yǎng)基，PROG+OGD組更換為預(yù)熱的含10 nmol/L孕酮的常糖工作液，轉(zhuǎn)移到37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常氧培養(yǎng)24 h。

2.4 形態(tài)學(xué)觀察 將培養(yǎng)板置于倒置相差顯微鏡下觀察各組細胞形態(tài)變化，各組均取板孔正中視野進行觀察并拍照。

2.5 WST－8比色法檢測細胞活力［4］將對數(shù)生長期的PC12細胞以5×107cells/L的密度接種于96孔板中培養(yǎng)，待細胞基本融合后，吸棄培養(yǎng)液，隨機進行分組。氧糖剝奪30 min并復(fù)氧復(fù)糖24 h后，每孔加入10 μL WST－8溶液。細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后，酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值(A)，630 nm參考波長進行雙波長測定。每組設(shè)4個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

2.6 LDH活性測定［5］收集各組細胞培養(yǎng)上清液，按LDH檢測試劑盒說明書進行操作，1 cm光程比色杯中加入工作液1 mL，細胞培養(yǎng)上清液200 μL，混合均勻，37℃保溫30 s，讀取初始吸光度，同時開始精確計時，1、2、3 min時分別讀取吸光度，確定每分鐘平均吸光度變化(ΔA/min)。LDH(U/L)=(ΔA樣品/min－ΔA空白/min)×F。F= 反應(yīng)總體積 ×1 000/樣品體積×消光系數(shù)。

2.7 RT－PCR檢測GLUT1和 GLUT3 mRNA水平 收集各組細胞，采用RT－PCR法檢測GLUT1和GLUT3 mRNA表達，采用Trizol試劑盒(Invitrogen)提取樣品中總RNA，操作按照試劑盒說明進行，A260/A280測定RNA純度，取2 μg逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)樣品分裝保存于－20℃。以 cDNA為模板，進行GLUT1、GLUT3和β－actin(內(nèi)參照)擴增。PCR反應(yīng)體系如下:10×PCR 緩沖液5 μL，MgCl2(25 mmol)3 μL，dNTPs(10 mmol)1 μL，上游引物(50 pmol)1 μL，下游引物(50 pmol)1 μL，模板 DNA 1 μg，DNA聚合酶(5×106U/L)0.5 μL，滅菌雙蒸水補至 50 μL。反應(yīng)條件為:94℃ 2 min進行循環(huán);94℃ 1 min，50℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán) 30次(β－actin循環(huán)25次)，再72℃ 5 min。使用PCR擴增儀(Biometra)進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物 10 μL與 DNA marker DL2000一起在含溴化乙啶2.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離。電泳條帶用NIH圖像軟件ImageJ進行灰度分析，以目的基因條帶/β－actin帶的灰度值表示該目的基因mRNA相對含量。所用引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列詳見表1。

表1 引物序列Table 1.Primer sequences

2.8 Western blotting檢測GLUT3蛋白表達 收集PC12細胞后，加入細胞裂解液，冰上裂解20 min，超聲1 s，間隔5 s，連續(xù)5次，離心取上清，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取變性蛋白15 μg進行SDSPAGE電泳分離蛋白質(zhì)后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)漂洗、封閉后加入小鼠β－actin單克隆抗體(稀釋度為1∶5 000)和山羊GLUT3多克隆抗體(稀釋度為1∶200)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影并掃描，以 Band Scan 5.0凝膠圖像處理軟件進行各條帶灰度分析。以β－actin為內(nèi)參照，各組GLUT3與β－actin條帶灰度比值表示該GLUT3相對含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 PROG對氧糖剝奪PC12細胞形態(tài)的影響

正常對照組PC12細胞呈梭型，兩極伸出較長突起，有的突起可發(fā)出分枝，呈典型神經(jīng)元結(jié)構(gòu)特征，見圖1A;OGD組PC12細胞的密度降低，突起減少或消失，大部分細胞腫脹變圓，細胞有聚團現(xiàn)象，部分細胞裂解成碎片，見圖1B;PROG+OGD組細胞胞體腫脹程度較OGD組明顯減輕，大部分細胞仍呈梭形，有細而短的突起伸出，聚團現(xiàn)象不明顯，細胞碎片的形成減少，見圖1C。

2 PROG對氧糖剝奪PC12細胞活力的影響

WST－8比色法檢測細胞活力，A值與活細胞數(shù)成正比。OGD組A值降低，與正常對照組比較有顯著差異(P＜0.01)，而PROG+OGD組A值增高，顯著高于OGD組(P＜0.01)，提示孕酮可增加氧糖剝奪的PC12細胞的存活率，見表2。

Figure 1.Effect of PROG on morphology of PC12 cells injured by OGD(×400).A:normal control group;B:OGD group(the morphology changed obviously after OGD for 30 min and restoration for 24 h);C:PROG+OGD group(the morphology was much better than that of OGD group).圖1 PROG對氧糖剝奪損傷PC12細胞形態(tài)的影響

3 PROG對氧糖剝奪PC12細胞培養(yǎng)上清液中LDH活性的影響

LDH漏出量是衡量細胞損傷的重要指標(biāo)，與細胞損傷程度成正比。LDH活性檢測結(jié)果顯示，OGD組培養(yǎng)上清液中LDH活性明顯高于正常對照組(P＜0.01)，PROG+OGD組 LDH活性明顯低于OGD組(P＜0.01)，見表2。這提示PROG可減輕OGD對PC12細胞的損傷。

表2 PROG對氧糖剝奪損傷PC12細胞活力和LDH活性的影響Table 2.Effects of progesterone on the cell viability and LDH activity of PC12 cells injured by OGD(±s.n=12)

表2 PROG對氧糖剝奪損傷PC12細胞活力和LDH活性的影響Table 2.Effects of progesterone on the cell viability and LDH activity of PC12 cells injured by OGD(±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs normal group;▲▲P ＜0.01 vs OGD group.

Group Absorbance(A) LDH(U/L)Normal 0.986 ±0.060 687.5 ±82.7 OGD 0.600 ±0.050＊＊ 2 364.6 ±78.6＊＊PROG+OGD 0.766 ±0.031▲▲ 1 552.2 ±234.7▲▲

4 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT3 mRNA表達的影響

RT－PCR結(jié)果顯示，GLUT1 mRNA在正常對照組、OGD組與PROG+OGD組均未檢測到。正常對照組GLUT3 mRNA有基礎(chǔ)表達;OGD組GLUT3 mRNA表達上調(diào)，顯著高于正常對照組(P＜0.01);PROG+OGD組GLUT3 mRNA表達量明顯高于OGD組(P＜0.05)，見圖2。

5 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT3蛋白表達的影響

Western blotting檢測結(jié)果顯示，正常對照組PC12細胞GLUT3有少量基礎(chǔ)表達;OGD組PC12細胞GLUT3表達上調(diào)，明顯高于正常對照組(P＜0.01);而PROG+OGD組 GLUT3表達又明顯高于OGD組(P＜0.01)，見圖3。

討 論

孕酮被稱為神經(jīng)活性甾體。近年來研究表明孕酮有減少腦梗死面積［6］、提高認知能力和促進大腦功能恢復(fù)等作用。孕酮可通過抗興奮性氨基酸(excitativeamionacids，EAA)的神經(jīng)毒性作用、減輕Ca2+超載導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷、抗氧自由基作用、抗神經(jīng)元凋亡作用等多種途徑而起到神經(jīng)保護作用［7］。為排除體內(nèi)復(fù)雜內(nèi)環(huán)境的影響，進一步在體外印證孕酮抗缺氧缺血損傷的神經(jīng)保護作用并進一步探討其機制，本研究建立PC12細胞的體外氧糖剝奪模型，模擬體內(nèi)缺氧缺血條件，觀察孕酮對OGD損傷的PC12細胞形態(tài)、損傷程度、細胞活力及GLUT3表達的影響，結(jié)果顯示:孕酮可以減輕OGD所致的PC12細胞腫脹，減少LDH漏出，從而減輕細胞損傷，并且提高細胞活力。這些結(jié)果提示在體外孕酮對OGD損傷的PC12細胞具有保護作用。這與前人及我們前期體內(nèi)動物研究所得到的孕酮對缺氧缺血損傷具有保護作用的結(jié)果相一致［1－3，8］。

Figure 2.Effects of PROG on the expression of GLUT1(A)and GLUT3(B)mRNA in PC12 cells injured by OGD.1:normal group;2:OGD group;3:PROG+OGD group;M:marker.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲P ＜0.05 vs OGD group.圖2 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT1和GLUT3 mRNA表達的影響

Figure 3.Effect of PROG on the expression of GLUT3 protein in PC12 cells injured by OGD.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs normal group;▲▲P ＜0.01 vs OGD group.圖3 PROG對氧糖剝奪PC12細胞GLUT3蛋白表達的影響

血液中的葡萄糖通過血腦屏障進入腦組織需要借助葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白這一運載工具來完成。GLUT3是神經(jīng)元上的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，負責(zé)將葡萄糖轉(zhuǎn)運入神經(jīng)元內(nèi)［9－10］。在人腦中神經(jīng)元的 GLUT3表達量明顯高于膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞，本實驗在PC12細胞沒有檢測到GLUT1 mRNA的表達，成為PC12細胞具有神經(jīng)元屬性的又一佐證。GLUT3對葡萄糖親合力高，其轉(zhuǎn)運效率比其它轉(zhuǎn)運蛋白要高，這有利于神經(jīng)元對葡萄糖的攝取，反映了腦細胞代謝旺盛的特點［11－12］。實驗室前期研究工作已經(jīng)表明，孕酮上調(diào)新生鼠腦缺氧缺血海馬組織GLUT1、GLUT3 mRNA 及蛋白的表達［3，8］。而本實驗結(jié)果顯示，正常對照組PC12細胞表達少量GLUT3 mRNA和蛋白，而OGD后GLUT3 mRNA和蛋白的表達增高，PROG干預(yù)后GLUT3 mRNA和蛋白表達較OGD組又顯著增加，這一結(jié)果與本室前期在體動物研究結(jié)果相吻合。該結(jié)果提示，上調(diào)GLUT3表達是神經(jīng)元對抗OGD損傷的內(nèi)源性保護機制之一，而孕酮可通過增強GLUT3表達進一步啟動和促進該保護機制的進行從而發(fā)揮其抗OGD損傷的保護作用。

缺氧缺血時GLUT3上調(diào)可能與低氧情況下增加低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxia－inducible factor 1，HIF－1)的表達有關(guān)。HIF－1是一種隨著細胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)其靶基因表達的轉(zhuǎn)錄激活因子，是由α和β亞基組成的一種異二聚體。有報道在局灶性腦缺血中，梗死周圍慢性缺血區(qū)域的HIF－1α表達增高［13］。HIF－1α除了介導(dǎo)缺氧應(yīng)答外，對腦缺血后的神經(jīng)損傷有保護作用，在腦缺血損傷和保護機制中起重要作用。Baranova等［14］研究結(jié)果顯示，當(dāng)機體遭受缺血缺氧損傷時HIF－1α表達增加，通過介導(dǎo)缺氧應(yīng)答反應(yīng)，增加其靶基因的轉(zhuǎn)錄，對機體有一定的保護作用。受HIF－1直接作用的靶基因有60多個，包括促紅細胞生成素、血管內(nèi)皮生長因子、cyclin G2、NIP3、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、乳酸脫氫酶、醛縮酶A、烯醇化酶、轉(zhuǎn)錄蛋白、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、內(nèi)皮素－1等等［15］。這些靶基因產(chǎn)物或能增加缺氧組織的氧供應(yīng)，或能降低細胞耗氧量，或增加葡萄糖的轉(zhuǎn)運等等，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使機體對缺氧產(chǎn)生耐受與適應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)GLUT3 mRNA表達在PROG組中顯著增高，GLUT3蛋白水平的表達與mRNA相一致，PROG+OGD組GLUT3 mRNA、GLUT3蛋白表達不僅明顯高于正常對照組，也高于OGD組。這些結(jié)果提示，孕酮可能通過上調(diào)HIF －1α靶基因GLUT3的表達提高缺氧缺血時神經(jīng)元對葡萄糖的轉(zhuǎn)運效率，增強神經(jīng)元對缺氧缺血的耐受，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。本研究為孕酮用于臨床治療腦卒中奠定了理論基礎(chǔ)。

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