劉宇宏， 王莎莎， 沈凌汛， 徐玉蘭

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，湖北武漢430022)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)的早發(fā)心血管事件是同年齡、同性別未患該類疾病普通人群的4～5倍，其原因目前認(rèn)為與RA慢性炎癥導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷及中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移并異常增生，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、演變與進(jìn)展［1－2］。白細(xì)胞介素－32γ(interleukin－32γ，IL－32γ)是新近發(fā)現(xiàn)的一種致炎細(xì)胞因子［3－4］，有研究發(fā)現(xiàn)它在RA的啟動(dòng)與進(jìn)展中發(fā)揮作用［5－7］，但它對(duì)在RA動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展中起關(guān)鍵作用的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)增生是否產(chǎn)生影響尚不清楚。本研究擬通過觀察IL－32γ對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs增殖及細(xì)胞周期的影響，探討其在RA早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 材料

清潔級(jí)SD大鼠，4周齡，(180±20)g，雌雄不限，購(gòu)自同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;含1×105U/L青霉素和100 mg/L硫酸鏈霉素的完全達(dá)氏修正依氏培 養(yǎng) 基 (Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)、10%胎牛血清購(gòu)自HyClone;II型膠原酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］和吡咯烷二硫代氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)購(gòu)自 Sigma－Aldrich;Annexin V－FITC/PI試劑盒購(gòu)自南京博泰生物技術(shù)有限公司;鼠抗β－actin、組蛋白H3(histone H3)、核因子－κB p65(nuclear factor kappa B p65，NF－κB p65)、cyclin D1和增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗體購(gòu)自Santa Cruz;IL－32γ購(gòu)自R＆D。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取4周齡SD大鼠胸主動(dòng)脈，按常規(guī)組織貼塊方法分離、原代培養(yǎng)VSMCs，0.5%胰酶消化傳代，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)采用3～8代細(xì)胞。

2.2 細(xì)胞增殖分析 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的VSMCs，以含10% 胎牛血清的培養(yǎng)基制備為1×107/L細(xì)胞懸液，每孔200 μL分別接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，細(xì)胞同期化后分組處理。(1)對(duì)照組:IL－32γ的終濃度為0 μg/L;(2)實(shí)驗(yàn)組:每孔分別加入 10、20、50 μg/L IL－32γ;(3)IL－32γ+PDTC 組:PDTC(終濃度20 μmol/L)預(yù)處理1 h后加入 IL－32γ(終濃度50 μg/L)。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，然后在含10% 胎牛血清的培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)24和48 h。干預(yù)結(jié)束時(shí)每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，再加入DMSO 200 μL，振蕩溶解細(xì)胞，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A490處的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 細(xì)胞周期分析 VSMCs按2×108/L接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞同期化后分組處理。實(shí)驗(yàn)組加入IL－32γ 50 μg/L，對(duì)照組和 IL－32γ +PDTC 組處理方法如前述。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，然后在含10% 胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇于4℃固定30 min，RNaseA(100 mg/L)37℃水浴30 min，加碘化丙啶(50 mg/L)，以流式細(xì)胞儀(FACS Calibur)進(jìn)行細(xì)胞周期分析。每個(gè)樣本檢測(cè)1×107個(gè)細(xì)胞。

2.4 免疫印跡法檢測(cè)cyclin D1和核內(nèi)NF－κB p65蛋白的表達(dá) 按上述方法處理VSMCs，培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞1×109/L，提取胞質(zhì)和核蛋白。取25 μg以10%SDS－PAGE電泳分離，于低溫100 V 3 h將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，加封閉液2 h阻斷非特異性抗體結(jié)合位點(diǎn)，將膜與溶于封閉液中的Ⅰ抗室溫下孵育2 h，磷酸鹽緩沖液(phosphate－buffered saline，PBS)洗3次×5 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫下結(jié)合1 h，PBS緩沖液沖洗后，標(biāo)準(zhǔn)ECL法底物發(fā)光并顯影。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)PCNA的表達(dá) 6孔培養(yǎng)板中加人蓋玻片，VSMCs按1×109/L細(xì)胞密度接種，細(xì)胞長(zhǎng)滿蓋玻片后按上述步驟加藥、培養(yǎng)。24 h和48 h收集蓋玻片，PBS液沖洗，純丙酮固定8 min，制成細(xì)胞爬片。I抗選用小鼠抗人PCNA單克隆抗體。按SP法染色試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行操作。每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 VSMCs形態(tài)特點(diǎn)

將大鼠VSMCs分離、培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞為梭形，有較長(zhǎng)突起，呈典型“峰－谷”樣生長(zhǎng)，見圖1。

2 IL－32γ對(duì)細(xì)胞增殖的影響

MTT比色法檢測(cè)表明，實(shí)驗(yàn)組在接種24和48 h后的細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組比較顯著增多，且呈濃度和時(shí)間依賴性;提前1 h加入PDTC預(yù)處理，顯著抑制了IL－32γ的促增殖作用(分別 P＜0.05，P＜0.01)，見表 1。

3 IL－32γ對(duì)細(xì)胞周期的影響

IL－32γ刺激細(xì)胞24 h后，實(shí)驗(yàn)組處于G1期的細(xì)胞比例為(38±4)%，較對(duì)照組［(69±5)%］顯著降低，處于S+G2期的細(xì)胞比例為(62±5)%，較對(duì)照組［(31±3)%］明顯提高(均 P＜0.01);加用PDTC預(yù)處理后，IL－32γ+PDTC組G1期的細(xì)胞比例為(60±5)%，處于S/G2期的細(xì)胞比例為(37±4)%，與實(shí)驗(yàn)組比較差異顯著(均P＜0.01)，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

Figure 1.Morphology of VSMCs at the third passage under inverted microscope(×100).圖1 倒置顯微鏡下第3代VSMCs形態(tài)

表1 各組VSMCs的MTT檢測(cè)結(jié)果Table 1.Absorbance(A)values of VSMCs in different groups detected by MTT assay(±s.n=3)

表1 各組VSMCs的MTT檢測(cè)結(jié)果Table 1.Absorbance(A)values of VSMCs in different groups detected by MTT assay(±s.n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control at the same time;△△P ＜0.01 vs 24 h in the same group;▲▲P ＜0.01 vs IL－32γ(10 μg/L)at the same time;##P ＜0.01 vs IL－32γ (50 μmol/L)+PDTC(20 μmol/L)at the same time.

Group 24 h 48 h Control 0.36 ±0.03 0.52 ±0.04△△IL－32γ(10 μg/L) 0.45 ±0.03* 0.63 ±0.06＊＊△△IL－32γ(20 μg/L) 0.57 ±0.04＊＊▲▲## 0.75 ±0.07＊＊△△▲▲##IL－32γ(50 μg/L) 0.64 ±0.06＊＊▲▲## 0.84 ±0.08＊＊△△▲▲##IL－32γ(50 μg/L)+PDTC(20 μmol/L) 0.40 ±0.03 0.56 ±0.05△△

Figure 2.Flow cytometry analysis of cell cycle圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

4 IL－32γ對(duì)cyclin D1和NF－κB p65表達(dá)的影響

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組cyclin D1和NF－κB p65的蛋白表達(dá)(分別為0.86±0.05和1.16±0.06)顯著高于對(duì)照組(分別為0.47±0.03和0.58±0.05)(均P＜0.01);IL－32γ+PDTC組的 cyclin D1和NF－κB p65蛋白表達(dá)(分別為0.58±0.04和0.70±0.05)較實(shí)驗(yàn)組顯著降低(均P＜0.01)，但仍高于對(duì)照組(均P＜0.05)，見圖3。

5 IL－32γ對(duì)PCNA表達(dá)的影響

Figure 3.The expression levels of cyclin D1 and NF－κB p65 proteins in different groups(Western blotting).1:control group;2:IL－32γ group;3:IL－32γ+PDTC group.圖3 免疫印跡檢測(cè)各組細(xì)胞cyclin D1和NF－κB p65的蛋白表達(dá)

PCNA以細(xì)胞核棕黃色為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)組第24和48 h的PCNA陽(yáng)性表達(dá)量分別為(60.3±5.0)%和(73.1±6.2)%，顯著高于對(duì)照組的(38.1±4.2)%和(51.7±4.5)%(均 P＜0.01);IL－32γ+PDTC組第24、48 h的PCNA陽(yáng)性表達(dá)量分別為(40.1±4.0)%和(55.1±5.0)%，較實(shí)驗(yàn)組顯著降低(均P＜0.01)，但與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，見圖4。

Figure 4.The immunocytochemical staining results of PCNA expression in each group(×200).A:control 24 h;B:control 48 h;C:IL－32γ 24 h;D:IL－32γ 48 h;E:IL－32γ+PDTC 24 h;F:IL－32γ+PDTC 48 h.圖4 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)各組細(xì)胞PCNA表達(dá)

討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的心血管發(fā)病率與死亡率明顯升高與其早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，RA和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有著十分相似的特征，這些特征包括均有細(xì)胞因子參與、自體反應(yīng)T細(xì)胞浸潤(rùn)、黏附分子表達(dá)、膠原降解和新生血管形成等［1］。導(dǎo)致RA患者滑膜損傷的炎癥機(jī)制同時(shí)轉(zhuǎn)入了血管壁損傷并啟動(dòng)了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程［1］。

VSMCs的異常增殖是動(dòng)脈粥樣硬化過程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。作為一個(gè)病理過程，其異常增殖受多方面的因素的影響與調(diào)控，諸如細(xì)胞因子［8］、趨化因子、生長(zhǎng)因子等。晚近有研究發(fā)現(xiàn)IL－32γ高表達(dá)于RA患者的血管壁，且與內(nèi)皮功能失調(diào)密切相關(guān)［9］，但它對(duì)VSMCs增殖的影響尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，10 μg/L以上的 IL－32γ可以濃度和時(shí)間依賴性地使VSMCs增殖加快。提示IL－32γ對(duì)體外培養(yǎng)的VSMCs有促增殖作用。PCNA含量隨細(xì)胞不同周期而改變，其量的變化與DNA合成一致，可反映細(xì)胞增殖活性的變化。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，PCNA在IL－32γ組中的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，表明細(xì)胞的DNA合成增多，即細(xì)胞增殖加快，與MTT檢測(cè)法的結(jié)果一致。這與文獻(xiàn)報(bào)道IL－32表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖［10］、敲除IL－32基因可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖是一致的［11］，表明IL－32γ的確是一個(gè)與細(xì)胞增殖相關(guān)的細(xì)胞因子。

細(xì)胞周期長(zhǎng)短是影響細(xì)胞增殖快慢的重要因素之一。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用50 μg/L IL－32γ刺激48 h后，實(shí)驗(yàn)組處于G1期的細(xì)胞比例較對(duì)照組降低，處于S+G2期的細(xì)胞比例較對(duì)照組提高。表明IL－32γ的促細(xì)胞增殖作用與加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化密切相關(guān)。

細(xì)胞周期受細(xì)胞周期素(cyclins)的調(diào)控。Cyclin D1在調(diào)控細(xì)胞通過G1期檢驗(yàn)點(diǎn)發(fā)揮重要作用，通過G1期檢驗(yàn)點(diǎn)的細(xì)胞將不可逆轉(zhuǎn)地完成整個(gè)細(xì)胞分裂過程［12］。Cyclin D1表達(dá)上調(diào)可以加速細(xì)胞通過整個(gè)細(xì)胞周期［13－15］。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)IL－32γ對(duì)cyclin D1表達(dá)的影響。結(jié)果表明，cyclinD1在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。表明IL－32γ在cyclin D1表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用。上調(diào)cyclin D1表達(dá)可能是IL－32γ加速細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化的原因之一。

已知NF－κB可以通過轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)cyclin D1而控制細(xì)胞生長(zhǎng)［16］。有研究報(bào)道IL－32γ可激活人樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞的NF－κB信號(hào)通路［17－18］，但在VSMCs中是否存在這種機(jī)制尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組核內(nèi)NF－κB p65的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。提示IL－32γ可誘導(dǎo)RA－FLS中NF－κB活化。為了進(jìn)一步了解該信號(hào)通路的活化與IL－32γ促細(xì)胞增殖作用間的相關(guān)性，我們較IL－32γ提前1 h加用NF－κB抑制劑PDTC預(yù)處理VSMCs，結(jié)果顯示，PDTC顯著抑制IL－32γ的促細(xì)胞增殖反應(yīng)、促細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化和上調(diào)NF－κB p65與cyclin D1表達(dá)的作用。提示IL－32γ的確能通過激活NF－κB信號(hào)通路上調(diào)cyclin D1表達(dá)，進(jìn)而縮短細(xì)胞周期和促進(jìn)細(xì)胞增殖。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL－32γ能夠在體外促進(jìn)VSMCs增殖。表明IL－32γ作為炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中的一個(gè)重要細(xì)胞因子，不僅參與了RA關(guān)節(jié)損傷的啟動(dòng)與進(jìn)展，而且在RA早發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用，可能是RA及其心血管并發(fā)癥治療的一個(gè)新靶標(biāo)。

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