秦 臻， 黃水清

(廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510405)

動脈內皮細胞的損傷和功能失調是動脈粥樣硬 化(atherosclerosis，AS)發(fā)生發(fā)展的關鍵因素，內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管內皮損傷再生和修復中起著主要作用，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及基質細胞衍生因子1(stromal cells derived factor 1，SDF－1)在EPCs的調節(jié)機制中具有重要作用。當歸補血湯(Danggui Buxue decoction，DBD)具有較好的調血脂和抗氧化作用[1]，并能抑制相關炎癥因子來保護AS中受損血管內皮。本文將探討當歸補血湯對AS病程中EPCs的相關影響及可能作用機制。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

M199培養(yǎng)液(M199 medium，Gibco)，胎牛血清(PAA)，淋巴細胞分離液(天津灝洋生物科技有限公司)，F(xiàn)ITC標記荊豆凝集素1(FITC－labeled Ulex europaeus agglutinin，F(xiàn)ITC － UEA －1，Sigma)，DiI標記的乙?；兔芏戎鞍?DiI－labelled acetylated low－density lipoprotein，DiI－ac－LDL，Invitrogen)，血管內皮生長因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF，PeproTech)，堿性成纖維細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF，PeproTech)，Transwell小室(Corning)，體外血管生成試劑盒(Corning)，辛伐他汀(杭州默沙東公司)，熒光顯微鏡(Leica)。

2 方法

2.1 制備當歸補血湯水煎液 藥材經(jīng)廣州市藥檢所鑒定為道地藥材，按原方中黃芪(甘肅)和當歸(甘肅)5∶1配伍比例稱取生藥，每克生藥加水6 mL浸泡30 min，煮沸后再文火慢煎40 min，趁熱過濾，濾液自然滴盡，二煎每克生藥加水4 mL，煎法同前，合并濾液，60℃水浴濃縮成含1 kg/L生藥的水煎液。密封，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 模型復制[2]新西蘭兔10只，雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學動物中心提供，合格證號為0014280，體重2.0～3.0 kg，普通飼料喂養(yǎng)1周后分為2組，每組5只。正常組予以普通飼料喂養(yǎng)，模型組予以牛血清白蛋白(250 mg/kg)一次性耳緣靜脈注射，每天喂以每2 kg含1 g膽固醇的高脂飼料，連續(xù)4周后空氣栓塞處死動物，取主動脈弓部，HE染色，觀察主動脈動脈粥樣硬化斑塊情況;并于心臟房室溝直下方每隔0.3 cm 作一橫切面，共切3塊，每塊厚約0.25～0.3 cm，均作脂肪染色。動脈粥樣硬化按管腔阻塞程度分為4級:斑塊阻塞管腔在25%以下者為1級，斑塊阻塞管腔在25% ～50%者為2級，斑塊阻塞管腔在51%～75%者為3級，斑塊阻塞管腔在75%以上甚至使管腔完全閉塞者為4級。

2.3 動物分組及取材 新西蘭兔25只，雌13、雄12只，廣東省實驗動物中心提供，合格證號為0072402，體重1.8 ～2.2 kg，全部動物按2.2 方法造模結束后，按體重隨機分為模型組、辛伐他汀組、當歸補血湯高、中、低劑量組，每組5只。按動物與人等效劑量折算，當歸補血湯高、中、低劑量分別予以當歸補血湯 6 g/kg、3 g/kg、1.5 g/kg 灌胃，辛伐他汀組予以辛伐他汀水懸液1.7 mg/kg，模型組予以等量蒸餾水，灌胃2周，每周測體重1次以調整給藥劑量。灌胃結束禁食12 h后，腹腔麻醉動物，腹主動脈采血，真空負壓管采取6 mL新鮮血及30 mL EDTA抗凝血。

2.4 EPCs的培養(yǎng) 抗凝血用PBS按1∶1稀釋，稀釋后的抗凝血按1∶1緩慢加入淋巴細胞分離液上層，2 500 r/min離心25 min，吸出單個核細胞層，然后用PBS以1 500 r/min×5 min洗滌2次。用M199全培養(yǎng)基(含 20%FBS，1×105U/L青、鏈霉素，10 μg/L VEGF和 bFGF)重懸后計數(shù)，以 5×109cells/L接種于纖維連接蛋白包被的24孔板中，培養(yǎng)至第4 d換液1次，收集培養(yǎng)第7 d的細胞檢測。

2.5 EPCs的鑒定[3]貼壁細胞棄上清，加入含2.4 mg/L DiI－ac－LDL的M199培養(yǎng)液孵育1 h后，PBS浸洗，4%多聚甲醛固定20 min，再加入10 mg/L FITC－UEA－1，孵育1 h后再次用PBS浸洗，避光干燥封片，熒光顯微鏡下觀察細胞吞噬乙酰化低密度脂蛋白及結合荊豆凝集素1的能力。

2.6 增殖能力測定 0.25%胰酶消化收集各組細胞，重懸計數(shù)，將等量EPCs接種于96孔板，細胞貼壁后，每孔加入5%MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振蕩10 min，置酶標儀讀取A值。實驗重復3次。

2.7 黏附能力測定[4]將等量的 EPCs接種于96孔板上，每組設3個復孔，孵育30 min后移去上清及未貼壁細胞，加入PBS，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野(×200)計數(shù)貼壁細胞。

2.8 遷移能力測定 將等量的EPCs加入Transwell小室的上室，下室加入含50 μg/L VEGF培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棉簽擦去上室中的細胞，4%多聚甲醛固定，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下隨機選擇5個視野(×200)計數(shù)遷移至下層的細胞。實驗重復3次。

2.9 形成小管能力測定 將ECMatrix膠液和ECM 10×稀釋液置于4℃冰箱過夜，使之融化。每900 μL ECMatrix膠液加入 ECM 10×稀釋液100 μL，將混勻液加入96孔板，每孔50 μL，孵育1 h凝固成膠，將各組細胞以5 000 cells/well接種于膠上，每組設3個復孔，37℃培養(yǎng)24 h后，倒置顯微鏡每孔隨機選取5個視野(×200)計數(shù)長度為寬度4倍以上的細胞。

2.10 ELISA法檢測VEGF及SDF－1 6 mL兔血室溫靜置2 h，以3 000 r/min離心15 min后取上清，按試劑盒說明操作檢測，每個樣本重復3次，取平均值。

3 統(tǒng)計學處理

結 果

1 動物模型復制

正常家兔主動脈內膜等結構完整，內皮下無脂質沉積或斑塊形成，心臟切片均未發(fā)現(xiàn)冠狀動脈粥樣硬化斑塊;模型組主動脈內膜增厚，形成明顯的粥樣斑塊，可見大量泡沫細胞，心臟切片均可見到冠狀動脈內膜有粥樣硬化斑塊形成，斑塊經(jīng)油紅O染色證實是大量脂質沉著，脂肪染色管腔阻塞程度模型組為2級或3級，見圖1。

Figure 1.The pathological sections of rabbit coronary artery(oil red O staining，×200).A:control group;B:AS group.圖1 兔冠狀動脈病理切片

2 EPCs的鑒定

貼壁細胞經(jīng)DiI－ac－LDL和FITC－UEA－1處理后，熒光顯微鏡下DiI－ac－LDL和FITC－UEA－1雙染色陽性細胞為正在分化的EPCs，見圖2。

Figure 2.Identification of EPCs(×200).A:adherent cells with DiI－ac－LDL(red);B:cells binding FITC－UEA－1(green);C:double positive cells were differentiating EPCs.圖2 EPCs的鑒定

3 當歸補血湯對兔EPCs功能及血清VEGF、SDF－1表達的影響

湯高劑量組及中劑量組間作用效果無明顯差異，見表1、圖3。

與模型組比較，當歸補血湯高、中劑量組及辛伐他汀組兔血清VEGF和SDF－1濃度水平增高(P＜0.05)，且EPCs增殖、黏附、遷移和形成小管能力均有增強(P＜0.05)，低劑量組血清VEGF、SDF－1濃度及EPCs功能無明顯變化;辛伐他汀組、當歸補血

討 論

動脈血管內皮的損傷與修復始終貫穿于AS病程，內皮細胞的損傷和功能失調是AS形成最重要的一步，內皮在修復與損傷間的動態(tài)變化，將最終決定著AS的病變發(fā)展，因此內皮再生顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)[5－8]EPCs可參與血管內皮損傷后的再生與修復，EPCs活性維持在高水平可漸弱多重危險因素的致AS作用。然而，EPCs的數(shù)量及功能卻在AS相關疾病中受到明顯損害:在確診的冠心病患者中發(fā)現(xiàn)其EPCs的數(shù)量和非老化EPCs的數(shù)量顯著減少，并與冠狀動脈粥樣鈣化積分和股動脈中膜厚度呈負相關，進一步發(fā)現(xiàn)EPCs的數(shù)量和活性在穩(wěn)定的冠心病患者中與冠脈的狹窄程度密切相關，提示EPCs的數(shù)量降低和活性抑制加速AS進展。因此，通過移植正常功能或基因修飾的EPCs，或通過改善循環(huán)血中EPCs的數(shù)量及功能來修復內皮一直是近年研究的熱點。

表1 當歸補血湯對兔EPCs功能及血清VEGF、SDF－1水平的影響Table 1.Effects of DBD on functions of EPCs and serum levels of VEGF and SDF－1(±s.n=5)

表1 當歸補血湯對兔EPCs功能及血清VEGF、SDF－1水平的影響Table 1.Effects of DBD on functions of EPCs and serum levels of VEGF and SDF－1(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AS group.

Group VEGF(ng/L) SDF－1(μg/L) Proliferation(A) Adhesion(cells，×200) Migration(cells，×200)Angiogenesis(cells，×200)AS 27.98±16.22 2.01 ±0.48 0.19 ±0.07 132.7 ±37.8 217.0±35.9 11.0±2.2 Simvastatin 64.96±15.23* 2.96±0.39* 0.30±0.09* 249.6±78.3* 373.8±33.3＊＊ 19.6±4.2*High－dose DBD treatment 61.28±21.87* 2.84±0.42* 0.28±0.04* 224.9±75.4* 283.2±52.0* 16.8±4.7*Middle－dose DBD treatment 61.36±20.90* 2.71±0.46* 0.30±0.10* 232.4±39.4* 278.8±18.1* 16.6±6.2*Low －dose DBD treatment 34.45±11.03 2.23±0.41 0.22±0.05 152.4±43.1 232.6±38.9 8.6±2.1

Figure 3.Angiogenesis of EPCs in vitro(×100).A:tubule number is small in AS group;B:low －dose DBD treatment group;C，D，E:tubule number increased in middle－dose of DBD，high－dose of DBD and simvastatin groups.Obvious tube－like structure formation was found in D and E.圖3 EPCs的體外形成小管能力

AS作為一種緩慢發(fā)展的血管內膜炎性病變，其中醫(yī)主要病機為氣血不足，血脈瘀阻。當歸補血湯由黃芪5份及當歸1份組成，是益氣活血的經(jīng)典名方，已證實具有良好的血管內皮保護作用，能明顯改善兔AS模型主動脈粥樣硬化斑塊的面積及厚度[1]，可同時調控NF－κB及p38MAPK信號通路來抑制相關炎癥因子對內皮的損傷[9－10]。由于AS發(fā)展中存在著EPCs的耗竭，導致EPCs依賴性的動脈內皮缺乏修復，從EPCs這一角度來闡述當歸補血湯的內皮保護作用，將作為其保護機制的重要補充，并為臨床應用提供更有力的理論依據(jù)。

研究表明家兔EPCs數(shù)量及功能在AS病理狀態(tài)下均受到嚴重損害[11]，辛伐他汀[12]及益氣活血方藥補陽還五湯[13]均可明顯改善正常家兔外周血EPCs的功能，促進EPCs的分化。本文對AS病理狀態(tài)下EPCs進行研究，結果顯示當歸補血湯及辛伐他汀均可保護AS中受損的EPCs相關功能，同時也初步探討了其可能作用機制:VEGF和SDF－1在EPCs的調節(jié)中具有重要作用[14－15]，內皮損傷后釋放的VEGF和SDF－1分別與EPCs表面的特異性受體VEGF－R1、VEGF－R2和CXCR－4結合，誘導EPCs的增殖;而釋放的SDF－1能在骨髓和受損內皮間形成一個由高到低的濃度梯度，使EPCs逆著SDF－1濃度梯度到達受損內皮;VEGF亦可引起受損缺血部位EPCs的聚集，促進血管新生，同時 SDF－1和VEGF也是影響EPCs向內皮細胞分化的主要因子。研究表明當歸補血湯及辛伐他汀組兔血清VEGF、SDF－1較模型組維持在較高水平，這提示當歸補血湯可能通過維持循環(huán)VEGF和SDF－1水平來參與EPCs活性的調控，但這仍需進一步體外研究驗證。

盡管他汀類藥物能在短時間內動員EPCs修復損傷內皮，但長時間藥物治療可導致 EPCs的枯竭[16]，長時間應用當歸補血湯是否也會有同種弊端，益氣活血方藥能否穩(wěn)定有效地維持EPCs的活性仍值得進一步探究。

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