蔡劉體 ，商勝華 ，胡重怡 ，王麗麗 ，劉艷霞 ，汪漢成 ，楊興明 ，石俊雄*

1.貴州省煙草科學研究所，貴陽市金陽新區(qū)云潭北路 550081

2.南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境科學學院，南京市衛(wèi)崗童衛(wèi)路1號 210095

煙草青枯病是煙草的重要病害之一，幾乎分布于世界上所有的烤煙種植區(qū)，其中熱帶和亞熱帶煙區(qū)發(fā)病尤為嚴重［1］。在我國，煙草青枯病是危害南方煙區(qū)煙葉生產(chǎn)的主要病害，一旦發(fā)病往往會造成整株死亡，造成重大經(jīng)濟損失［2-3］。目前，在煙葉生產(chǎn)過程中盡管采用化學藥劑防治［4-6］、生物防治［7-9］、合理輪作［8，10-11］、種植抗病品種［12-14］、調整土壤微生物和調整煙苗移栽期等綜合措施來防治煙草青枯病［15］，但仍無法有效控制該病的發(fā)生。在煙草青枯病生物防治研究方面，目前主要是利用青枯菌的拮抗微生物來防治煙草青枯病，雖然篩選拮抗微生物及其在實驗室或溫室中拮抗試驗效果不錯的研究報道較多［16-18］，但是在大田生產(chǎn)上卻鮮有應用成功的報道。主要原因之一是植煙土壤是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng)，耕作層土壤中微生物眾多，包含細菌、真菌和病毒等,其微生物的多樣性和復雜性對青枯菌的拮抗微生物定殖和擴繁有一定影響。因此，分析煙草青枯病土壤中微生物的群落結構，將有利于拮抗微生物的定殖、擴繁和拮抗作用的發(fā)揮。目前，對土壤微生物群落的分析，尤其是快速分析非常困難［19］，隨著分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展以及PCR（Polymerase Chain Reaction）技術的日趨成熟，一些建立在 PCR技術基礎上的分子生物學分析方法如變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE）［20］、末端 限制性片段多態(tài)性（terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP）和16S保守區(qū)域片段文庫的構建［21］等技術已經(jīng)發(fā)展起來。這些方法不需要培養(yǎng)、分離和純化微生物，也不受微生物是否可在實驗室培養(yǎng)的限制,解決了傳統(tǒng)微生物多樣性分析中的一些分離培養(yǎng)方面的問題。本研究利用微生物保守區(qū)域片段文庫構建，初步分析了煙草青枯病土中細菌、真菌的多樣性，旨在為利用青枯病拮抗菌有效防治該病害提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

煙草青枯病土壤取自貴州省煙草科學研究所福泉煙草青枯病病圃。五點混合法采集土壤樣品，取土壤表層8～20 cm的土層，過0.2 mm篩，去除雜質。

微生物保守區(qū)域片段的擴增引物（表1）由上海生工生物有限公司合成；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DNA Marker、dNTPs、DNA聚合酶、連接酶、克隆載體等試劑購自大連寶生物（TAKARA）有限公司；序列測定由上海生工生物有限公司完成。

表1 用于微生物保守區(qū)域擴增的引物信息Tab.1 The informtion of primers used to amplify themicrobial conservative fragments

1.2 方法

1.2.1 土壤總DNA的提取和檢測

采用玻璃珠均質和液氮研磨法相結合以及SDS-CTAB法，提取病圃土壤中微生物DNA，用純化試劑盒純化獲得DNA。

采用瓊脂糖凝膠電泳法檢測土壤微生物總DNA和PCR擴增產(chǎn)物。

1.2.2 PCR擴增與DNA純化

以土壤微生物總 DNA為模板，8f，926r；338F，518R為引物對進行PCR擴增。反應體系總體積為25.0 μL，其中模板（土壤DNA）1.0 μL，正向引物和反向引物（10 μmol/μL）各1.0 μL，10×PCR Buffer（含有Mg2+）2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/μL）1.0 μL，Taq（5 U/μL）0.2 μL，蒸餾水補體積至25.0 μL；反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性40 s，55℃變性50 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；最后，72℃ 延伸10 min。

按照TAKARA公司凝膠回收試劑盒說明書操作，對PCR擴增產(chǎn)物進行回收，用瓊脂糖凝膠電泳檢測回收產(chǎn)物。

1.2.3 微生物多樣性初步分析

保守區(qū)域文庫中檢測為陽性的單克隆由上海生工生物公司測序。獲得的序列信息通過NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)及EzTaxon網(wǎng)站(www.eztaxon-e.org)進行在線分析和比對。

2 結果與分析

2.1 煙草青枯病土壤微生物總DNA提取

瓊脂糖凝膠電泳檢測提取純化后的土壤微生物總DNA，結果顯示提取的DNA大小約在2.0～10.0 kb范圍之間，通過DNA試劑盒的純化，可以降低土壤中腐植酸以及多酚類等化合物對PCR反應的影響。

2.2 煙草青枯病土壤微生物16S-rRNA和ITS保守序列文庫構建

以純化的DNA為模板，用細菌特異性8f和926r引物、真菌特異性338F和518R引物，經(jīng)過PCR擴增，獲得與預期片段大小一致的條帶，分別在1000 bp和300 bp左右。分別用8f，926r引物；338F，518R引物擴增的產(chǎn)物構建文庫，從文庫中隨機挑取部分單菌落，用PCR方法檢測其攜帶的片段，部分瓊脂糖電泳檢測結果如圖1所示，圖1表明隨機挑取的大多數(shù)單菌落攜帶有目的條帶。陽性克隆的序列的測定由上海生工生物有限公司完成。

圖1 PCR檢測隨機挑取的單克隆菌落的插入片段Fig.1 Detection of the insert fragments by PCR from some clones selected randomly

2.3 煙草青枯病土壤細菌類和真菌類微生物的多樣性

煙草青枯病土壤中獲得的細菌類信息如表2所示，結果顯示，土壤中含有假單胞桿菌屬類和鞘氨醇桿菌類等豐富細菌類微生物種類，其中包含部分不可培養(yǎng)假單胞桿菌、芽孢菌等細菌，還有部分序列通過比對沒有獲得相似性比較高的信息。表3結果顯示煙草青枯病土壤中真菌類包括黑霉菌，腐質霉屬真菌，尖孢鐮刀菌及一些不可培養(yǎng)的真菌，其中霉菌類和不可培養(yǎng)的真菌類包括的菌類比較豐富。

表2 煙草青枯病病圃土壤微生物中部分細菌信息Tab.2 Partial bacteria information of soil microbes from tobacco bacterial wilt disease nursery

表3 煙草青枯病病圃土壤微生物中部分真菌類信息Tab.3 Partial fungi information of the soil microbes from tobacco bacterial wilt disease nursery

3 小結與討論

土壤中微生物群落的快速分析比較困難，采用遺傳物質水平上分析微生物的多樣性，既克服了以往用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術來分析土壤微生物費時費力的缺點，又可挖掘不可培養(yǎng)的微生物信息，因此末端限制性片段多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳等分子手段已廣泛地應用于環(huán)境微生物多樣性分析，以及微生物生態(tài)研究和檢測［22-23］。但這些不依賴培養(yǎng)的分子生物學分析方法都依賴于所提取的土壤微生物總DNA的質量［24-26］。土壤中含有腐植酸、多酚類化合物、重金屬等多種生物活性抑制物，可能影響土壤DNA的提取質量，抑制DNA聚合酶的活性從而影響土壤微生物多樣性的分析，如果提取的DNA質量不高，如含有腐植酸或多酚類化合物，將影響后續(xù)微生物多樣性分析的效果。SDS和CTAB都可用于細胞裂解，用SDS-CTAB法提取土壤總DNA，既可達到裂解效果，還有助于去除腐殖酸，有利于提高所提取DNA的質量。本試驗采用SDS-CTAB法獲得了2.0～10.0 kb范圍片段的DNA，經(jīng)過純化后用于PCR擴增的模板，PCR擴增效果比較好。煙草青枯病病圃土壤微生物群落中含有伯克霍爾德氏菌（Burkholderia fungorum）、假單胞桿菌屬類（Pseudomonas graminis）、黑 霉 菌（Aspergillus niger）、尖 孢 鐮 刀 菌 屬（Fusarium oxysporum）等豐富的細菌類和真菌類微生物，也包括部分不可培養(yǎng)的微生物。

通過保守區(qū)域文庫構建，雖然通過測序獲得了部分的微生物遺傳信息，但仍然只是土壤中的部分信息。一方面可能是測序樣本還不夠多的原因，另一方面跟微生物保守區(qū)域文庫質量本身有很大的關系［27-28］。本研究只對細菌和真菌保守區(qū)域構建文庫，對土壤中的其它微生物（古生菌和病毒類）還不能全面認識，煙草青枯病土壤中微生物多樣性和可能發(fā)生的變化，尚需采用文庫構建與 DGGE 技術［20，29］、T-AFLP 技術［30］、高通量測序技術［31-32］或微生物芯片技術［33］相結合，綜合分析土壤中微生物多樣性的構成，這方面有待進一步試驗。

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