高清山，邢繼德，魏懷生，魯梅，燕淑海

（山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東青州262500）

山楂釀酒酵母的篩選及其發(fā)酵性能測定

高清山，邢繼德，魏懷生，魯梅，燕淑海

（山東濰坊工程職業(yè)學(xué)院，山東青州262500）

以山楂為原料,利用平板劃線分離法，得酵母9株。利用杜氏小管實驗對酵母進行篩選，獲得4株發(fā)酵力較強酵母。將其進行酒精、酸度、糖度的耐受性試驗，表明總體耐受性較好。將其與1450釀酒酵母共同進行發(fā)酵性能測定，確定了⑤號酵母是優(yōu)良菌株。在60 mg/L SO2和28℃的條件下，可釀造出11.3（體積比）酒精度，3.0 g/L還原糖，8.1 g/L總酸度，0.21澄清度，酒色鮮紅、口感純正、香味濃郁的山楂干紅酒。

山楂；釀酒酵母；篩選；發(fā)酵特性

Abstract:In this paper,9 strains of yeast were obtained by using hawthorn as raw material and using streak plate as separation method.Initially screened with Du-canaliculus experiments four strains of yeast with stronger fermentation capability were identified.Further tolerance testing on alcohol contents,acidity and sugar contents indicates that their overall performance of fermentation is better.Applied jointly with Saccharomyces cerevisiae No.1450,the No.⑤strain of yeast is determined to have the fermentation performance of excellent yeast.Under the conditions of 60 mg/L SO2and 28℃,the yeast can produce a wine with the following characteristics:alcohol 11.3(V/v),reductionsugar3.0g/L,totalacidity8.1g/L,clarity0.21,bright-red incolor,puretaste,andrichfragrance.

Key words：hawthorn;Saccharomyces cerevisiae;screening;fermentation characteristics

山楂，又稱仙果，幾乎含有水果的所有營養(yǎng)成分，18種氨基酸，特別是VC的含量較高，達到89 g，比蘋果高17倍，比梨高30倍。其主要成分有：山楂酸、黃酮、VC。主要功能：健胃消食、減肥、降血脂血壓、防衰老、增強肌體免疫力等。據(jù)《本草綱目》記載：山楂可消化飲食，消肉積癥瘕及痰飲痞滿吞酸、血瘀脹痛。據(jù)洪昭光《食物是最好的醫(yī)藥》介紹：山楂有很多的營養(yǎng)和醫(yī)療價值，常吃山楂制品能開胃消食，預(yù)防動脈粥樣硬化，使人延年益壽，故山楂被人們視為“長壽食品”。

山楂的品種很多，其中，以青州的敞口山楂最為有名。據(jù)青州府志記載，距今已有500多年的栽培歷史。敞口山楂果實扁圓形，果皮涂紅，果點黃白色，密集，果皮較粗糙，無光澤，因萼筒大而深，萼片開張而成“敞口”。青州敞口山楂個大、質(zhì)優(yōu)，適于加工，抗逆性強，適應(yīng)范圍廣，全國各地慕名到青州引種及購買者很多。近年來，由于深加工能力不足，青州山楂出現(xiàn)了相對的產(chǎn)大于銷的狀況，如何做好山楂果品的深加工，增加農(nóng)民收入，使山楂增產(chǎn)又增收，一直是果農(nóng)十分關(guān)注的問題。根據(jù)當(dāng)前我國干紅果酒走俏市場的有利形勢，對山楂干紅生產(chǎn)的工藝條件進行了探討，必將對當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟建設(shè)起到很好的推動作用，提供一條解決“三農(nóng)”問題的有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

青州山楂；白砂糖；麥芽；1450釀酒酵母。

1.2 儀器設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海將來實驗設(shè)備有限公司；手持糖度儀：上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司；超凈工作臺；發(fā)酵管；GC7890F氣相色譜儀：安捷倫科技有限公司；722S分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；全果榨汁機；殺菌設(shè)備；天平；顯微鏡等。

1.3 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：葡萄糖 5%，（NH4）2SO40.2%，KH2PO40.25%，MgSO4·7H2O 0.1%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01%，酵母膏0.05%，上述材料滅菌后加亞硫酸鈉至30 mg/L。

分離培養(yǎng)基：酵母膏3 g，蛋白胨5 g，麥芽汁3 g，葡萄糖8 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121℃蒸汽滅菌20 min，pH自然。

麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20%，酵母膏1%，麥芽汁3g，（NH4）2SO40.1%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O0.1%。

山楂汁發(fā)酵培養(yǎng)基：取山楂汁，稀釋調(diào)整成分，加入使發(fā)酵后生成15%（體積比）酒的白砂糖，加亞硫酸鈉至 30 mg/L，調(diào)pH3.5。

1.4 方法

1.4.1 山楂酒酵母的富集培養(yǎng)以及初步分離純化[1-3]

將成熟山楂搗碎放于無菌的三角瓶中，暴露于空氣中自然發(fā)酵，當(dāng)有氣泡產(chǎn)生并聞之有酒味時，用無菌紗布過濾，取過濾果汁50 mL加入富集培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)2 d～3 d，得到增殖培養(yǎng)液。將富集培養(yǎng)好的菌種通過初步分離純化得到單菌落。選取較大菌落，編號后分別接入富集培養(yǎng)基試管斜面上，28℃培養(yǎng)2 d～3 d，置于4℃冰箱中保存待用。

1.4.2 優(yōu)良山楂酒酵母篩選試驗[4-6]

1.4.2.1 山楂酒酵母的初篩

杜氏管發(fā)酵實驗法：將活化傳代的酵母接人帶有杜氏管的麥芽汁（10°Brix）培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48 h，接種量為1.0×107cfu/mL。

1.4.2.2 酵母耐性實驗

將菌種分別采用不同的乙醇濃度（4%、8%、12%、16%、20%）、pH（1.5、2.5、3.5、4.5、5.5）以及糖濃度（10%、20%、30%、40%、50%)的帶有杜氏管的麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3 d，選擇產(chǎn)氣好的菌株。接種量為1.0×107cfu/mL。

1.4.3 山楂酒酵母的復(fù)篩[7-9]

將初篩得到的耐性較好的酵母株接人山楂汁發(fā)酵培養(yǎng)基，將活化1450釀酒酵母后，作同條件對照試驗。

檢測方法：酒精度（以體積百分數(shù)計，%vol）采用氣象色譜法；殘還原糖（g/L）采用斐林法；酸度采用酸堿滴定法；澄清度采用分光光度計測定。

2 結(jié)果和分析

2.1 酵母菌株的分離[10-12]

富集培養(yǎng)后，經(jīng)稀釋以及劃線分離后挑出具有典型酵母菌落特征的菌株,用顯微鏡觀察形態(tài)特征，并經(jīng)酵母生理生化特性鑒定為酵母的共9株。

2.2 杜氏管發(fā)酵實驗

分離得到的9株酵母分別編號，進行杜氏管產(chǎn)氣實驗，培養(yǎng)5 d后結(jié)果如表1。

表1 杜氏管實驗Table 1 Experiment of Du-canaliculus

由表1可知，發(fā)酵24 h，有大量氣泡產(chǎn)生的菌株有1株（酵母⑤號），48 h發(fā)酵有大量氣泡產(chǎn)生的菌株有3株（酵母①號、③號、⑧號），這4株菌都有酒香生成，保留這4株進行下一步篩選實驗。

2.3 酵母耐受性實驗

2.3.1 酵母耐乙醇能力測定[13]

山楂酒在發(fā)酵過程，隨酒度不斷增加，在糖度還沒有下降到足夠低的時候，高濃度的酒精會抑制酵母的發(fā)酵；或者由于外因的影響，發(fā)酵醪突然中止發(fā)酵的情況下，必須添加處理好的山楂汁重新啟動發(fā)酵。因此，在這些情況下，酵母對較高酒精濃度發(fā)酵液的適應(yīng)能力顯得非常重要，表2為各種酵母在不同酒精濃度條件下的耐受情況。

表2 不同酵母的耐乙醇性結(jié)果Table 2 Alcohol tolerance results of different strains of yeast

由表2可以看出：4株酵母在12%的酒精度環(huán)境中，耐受性均較好，隨著酒精度的提高，酵母⑧號對較高濃度酒精的耐受性大大降低，其余3株耐受性較好。

2.3.2 酵母耐酸堿度測定[14]

山楂汁的酸性比較大，一方面可抑制有害菌的生長，避免發(fā)酵期間有害菌的感染，另一方面要求生產(chǎn)菌種必須具有較好的耐酸性能。因此在山楂酒酵母選育中，進行酵母的耐酸性測試非常重要，表3為不同pH下的酵母發(fā)酵情況。

表3 不同酵母的耐酸性的測試結(jié)果Table 3 Acidity tolerance results of different strains of yeast

由表3中可以看出：4株酵母在pH為3.5的環(huán)境中，耐受酸性均較好，在較低的pH下，酵母①號和酵母⑧號菌的耐受性明顯減弱，酵母⑧號菌尤為明顯。

2.3.3 酵母耐糖度測定[15-16]

在釀造山楂酒過程中，為了得到較高的酒精度，便于酒的保藏，需要調(diào)整加入更多的蔗糖，而糖濃度的增加對酵母滲透性可能產(chǎn)生影響，因此，要對篩選菌株進行耐糖度測試，表4為不同糖度下的酵母發(fā)酵情況。

表4 不同酵母在不同糖度下的充盈用時Table 4 Results different yeast in different sugar degree of fillingtime

由表4可以看出：4株酵母在20%左右的糖濃度環(huán)境中，發(fā)酵性能較好。但是，糖濃度降低，杜氏小管充盈時間延長；糖濃度提高，對酵母的抑制作用增強；當(dāng)糖濃度達到50%時，①號和③號酵母明顯受到抑制，幾乎喪失發(fā)酵功能；⑤號酵母的耐糖度性最好，⑧號酵母次之。

2.4 酵母發(fā)酵性能的測定[11-13]

選取成熟無霉變的山楂，去梗洗凈，稱量后去核打漿，稀釋后，加入一倍體積量的4%的脫臭酒精軟化水和10 mg/L的亞硫酸鈉，根據(jù)17.5 g/L的糖可生成1度酒精的比例再加入使發(fā)酵后生成12%（體積比）酒精度的白砂糖，加亞硫酸鈉至30 mg/L，調(diào)pH 3.5。將初篩得到的4株酵母、活化1450釀酒酵母分別以8%的接種量接人山楂汁發(fā)酵培養(yǎng)基，28℃靜止發(fā)酵5 d后，測定酒精度、還原糖、總酸度、澄清度，表5為測定情況。

表5 不同酵母發(fā)酵性能測定情況Table 5 Fermentation performance measurement results of different strains of yeast

由表5可以看出：⑤和③號酵母產(chǎn)酒精量分別為11.3和10.2（28℃、體積比），說明此2菌株產(chǎn)酒精能力最好；1450釀酒酵母和⑤號酵母對還原糖的利用能力最好；各項指標(biāo)綜合顯示：⑤號酵母酒體澄清度最好，酸度最低，口感好，香味重，是一優(yōu)良菌株，可以用于山楂酒生產(chǎn)，各項指標(biāo)顯示性能優(yōu)于1450釀酒酵母，命名為山楂一號酵母。

3 討論

本試驗結(jié)果表明，自然發(fā)酵山楂是分離篩選山楂酒酵母的良好材料，經(jīng)過分離、初篩、復(fù)篩和發(fā)酵性能測定，山楂一號酵母在相同條件下起酵時間為最短的13 h，在4%~20%酒精環(huán)境中有很好的耐受性，最佳耐受糖度為30%左右，最適pH為3.5左右，在60 mg/L SO2和28℃的條件下，可釀造出11.3（體積比）酒精度，3.0 g/L還原糖，8.1 g/L總酸度，口感純正、香味濃郁的山楂干紅酒，證明山楂一號酵母適合釀造山楂干紅酒。

本試驗僅報道了山楂一號的分離篩選及初步測定，但對其菌種的生理生化特性、培養(yǎng)特征、16SrDNA序列分析、以及形態(tài)特征、表面結(jié)構(gòu)和生化測定、細胞壁的成分分析尚未研究。另外，利用山楂一號酵母，對山楂干紅生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化研究，找出適合當(dāng)?shù)厣介杉t生產(chǎn)的最佳工藝尚需進一步研究[15-18]。

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Screening of Hawthorn Saccharomyces Cerevisiae and Measurements of Their Fermentation Performance

GAO Qing-shan,XING Ji-de,WEI Huai-sheng,LU Mei,YAN Shu-hai
（Weifang Engineering Vocational College,Qingzhou 262500,Shandong,China）

2011-11-26

山東省高等學(xué)校科技計劃項目（J10LC77）

高清山（1968—），男（漢），講師，本科，碩士，主要從事應(yīng)用微生物研究。