王碩，劉昕煜，吳懿娜，杜欣軍，朱超，張潔

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

西維因抗體庫的構(gòu)建及特異性克隆的篩選

王碩，劉昕煜，吳懿娜，杜欣軍，朱超，張潔

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

在計(jì)算機(jī)輔助下，設(shè)計(jì)并合成西維因半抗原，與載體蛋白KLH連接后免疫Balb/C小鼠，經(jīng)過5次免疫后，最高效價(jià)和特異性抑制率分別達(dá)到254000和26%；提取免疫后小鼠脾臟總RNA，純化mRNA后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用設(shè)計(jì)的兼并引物獲得長(zhǎng)度約為400 bp的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因片段，重疊延伸后獲得長(zhǎng)度約為780 bp的單鏈抗體基因。經(jīng)過EcoR I和HindⅢ酶切后，連入T7噬菌體臂，構(gòu)建西維因特異性的抗體庫，抗體庫原始滴度為1.74×107pfu。以西維因-OVA為配體對(duì)抗體庫進(jìn)行淘選，經(jīng)過4輪淘選后，利用直接ELISA對(duì)獲得噬菌體克隆進(jìn)行特異性檢測(cè)，西維因?qū)寺4-7和A4-16的抑制率分別達(dá)到54.1%和66.4%。經(jīng)過序列測(cè)定，2個(gè)克隆的輕鏈可變區(qū)分別由108和112個(gè)氨基酸構(gòu)成，重鏈可變區(qū)分別由117和112個(gè)氨基酸構(gòu)成。

西維因；噬菌體展示；重組抗體

Abstract:Carbaryl hapten,which was designed using computer softwares and synthesized by chemical synthesized methods,was connected with carrier protein KLH.Then Balb/C mice were immunized using the connected product as the immunogen.After 5 rounds of immunization,the highest titer and the specific inhibition rate of the immune serum reached 254000 and 26%respectively.Total RNA was extracted from the immunized mice spleen and mRNA was purified.The cDNA was obtained by reverse transcription and used as template for PCR amplification of variable regions of antibodies.The variable regions of light chain (VL)and heavy chain(VH)were about 400 bp in length.Then the single-chain antibody gene(scFv)about 780 bp was obtained with overlap PCR method.The scFv fragments were digested by restriction enzyme EcoR I and Hind III.The digestion production was ligated into T7 phage arms and the carbaryl-specific phage-displaying antibodylibrarywasconstructed.Afterexaminationoriginaltiteroftheprimaryphagelibraryreached1.74×107pfu.The antibody library was panning using carbaryl-OVA as the coating ligand.After 4 rounds of panning,affinities and specificities of the individual colonies were detected with direct ELISA and the inhibition rates of free carbaryl against clone A4-7 and A4-16 reached 54.1%and 66.4%respectively.Sequencing results indicated that the light chain variable regions of the 2 clones comprised 108 and 112 amino acids respectively.The heavy chain variable regions of the 2 clones comprised 117 and 112 amino acids respectively.

Key words：carbaryl;phage display;recombinant antibody

化學(xué)農(nóng)藥在防治有害生物和提高農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益方面發(fā)揮了重大作用[1]，成為提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量的重要措施之一[2]。但在農(nóng)藥的生產(chǎn)與使用過程中不僅會(huì)對(duì)土壤、大氣、水資源等造成污染，而且農(nóng)藥的殘留毒性會(huì)對(duì)環(huán)境生物及人體健康造成嚴(yán)重的危害。

西維因（Carbaryl），又名胺甲萘[3]，是世界上最早商品化的一種氨基甲酸酯類農(nóng)藥，它對(duì)昆蟲具有觸殺和胃毒作用，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的害蟲防治[4]。西維因常用的檢測(cè)方法包括氣相色譜、高效液相色譜以及色譜與質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)[5]。但是，這些檢測(cè)方法的樣品前處理技術(shù)復(fù)雜、耗時(shí)、耗力，必須有專業(yè)人員在專門的實(shí)驗(yàn)室操作，大大影響了實(shí)時(shí)性，導(dǎo)致市場(chǎng)監(jiān)測(cè)的滯后。免疫分析作為一種較為先進(jìn)的小分子物質(zhì)檢測(cè)方法[6]，具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的檢測(cè)。免疫分析法的分析時(shí)間短，檢測(cè)成本低，便于檢測(cè)人員現(xiàn)場(chǎng)操作[7]，但在抗體制備過程中小分子農(nóng)藥的半抗原不易合成、抗體獲得的周期較長(zhǎng)、動(dòng)物的選擇要求較高，且由于動(dòng)物個(gè)體差異導(dǎo)致批次間穩(wěn)定性差，不易于大量制備，這些缺點(diǎn)大大限制了其應(yīng)用的范圍。而基因工程抗體作為一種先進(jìn)形式的抗體[8]，具有分子量小、氨基酸組成清楚、便于基因改造、可大量制備、相對(duì)成本較低等優(yōu)勢(shì)，在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)抗體的缺陷。隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因工程抗體必定將在小分子有害物質(zhì)檢測(cè)中發(fā)揮越來越重要的作用。

本研究構(gòu)建了西維因特異性抗體庫，并從中篩選到2個(gè)親和性和特異性較為理想的克隆，為西維因基因工程抗體的制備與應(yīng)用提供了良好的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

雌性、六周齡Balb/c小鼠：購于北京軍醫(yī)大學(xué)；大腸桿菌DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

總RNA提取試劑盒：Qigen公司；mRNA純化試劑盒、Pfu DNA polymerase、EcoRI限制性內(nèi)切酶、Hind III限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶：Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒：上海生工生物技術(shù)有限公司；T7 select 10-3 cloning kit：Novagen 公司；西維因標(biāo)品：Chem Service公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、牛血清蛋白、羊抗鼠酶標(biāo)二抗：Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 半抗原的合成[7]

將萘酚溶于二氯甲烷與吡啶形成混合溶液，逐滴加入溶有對(duì)硝基苯氯甲酸酯的二氯甲烷，冰浴攪拌反應(yīng)5 h。反應(yīng)體系用3%的鹽酸振蕩洗滌，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，得到淡黃色的1-萘氧基-4-硝基苯碳酸酯晶體。溶解于pH為8.2的氫氧化鈉溶液的6-氨基己酸中逐滴加入溶有制得的1-萘氧基-4-硝基苯碳酸酯，冰浴下邊滴邊攪拌，反應(yīng)過夜。鹽酸酸化，干燥后柱層析純化，收集目標(biāo)組分，即為西維因的免疫原5H-KLH。

1.2.2 小鼠的免疫

使用西維因免疫原，腹腔常規(guī)免疫6周齡Balb/C雌性小鼠。每次的免疫劑量為200 μg/只，每?jī)芍苊庖咭淮?。使用間接Elisa法測(cè)定免疫后小鼠抗血清效價(jià)及特異性。

1.3 抗體庫構(gòu)建

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)小鼠抗體基因的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因序列及參考文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)合成26條輕鏈兼并引物和29條重鏈兼并引物[9-10]，并由上海生工公司合成。

1.3.2 小鼠脾臟mRNA提取及cDNA合成

選擇效價(jià)和特異性較高的小鼠摘取脾臟，用Qigen的總RNA提取試劑盒提取小鼠脾臟總RNA，洗脫的RNA用1%瓊脂糖凝膠成像檢測(cè)，凍存于-80℃?zhèn)溆?。將所提取的小鼠脾臟總RNA按所測(cè)OD值定量后，等比例混合后用磁珠分離純化mRNA。紫外分光光度計(jì)分析mRNA純度與濃度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)mRNA質(zhì)量后，取1 mg mRNA合成第一鏈cDNA。

1.3.3 輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)基因擴(kuò)增

分別將輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)的上下游引物等摩爾數(shù)混合，以cDNA為模板擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，輕鏈擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃2 min；95℃1 min，53℃1 min，72℃1min，循環(huán) 35 次；72℃10min。重鏈擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min；95℃ 1 min，58℃ 1 min，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72℃10 min。

1.3.4 重疊延伸PCR

分別取純化后的輕鏈、重鏈可變區(qū)各取50 ng，進(jìn)行無引物重疊延伸，程序如下：94℃1 min，63℃1 min，68℃1 min，循環(huán)20次。循環(huán)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入等體積除模板外的PCR反應(yīng)成分，所用引物為接頭引物，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃1 min，53℃1 min，72℃1 min，循環(huán)30次。電泳檢測(cè)后膠回收單鏈抗體基因。

1.3.5 抗體庫的構(gòu)建與滴度的測(cè)定

利用EcoRⅠ和Hind III對(duì)得到的scfv純化后進(jìn)行雙酶切，膠回收后進(jìn)行濃度測(cè)定，取0.06 pmol scFv與T7 select10-3b載體臂于16℃連接16 h，將連接產(chǎn)物與T7包裝提取物于22℃溫育2 h進(jìn)行體外包裝，加入270 μL LB培養(yǎng)基終止反應(yīng)，即構(gòu)建完成西維因原始抗體庫。按照T7試劑盒操作說明對(duì)原始抗體庫滴度進(jìn)行測(cè)定，液體擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增后抗體庫進(jìn)行滴度測(cè)定。

1.4 特異性噬菌體克隆的淘選

1.4.1 包被原的合成[7]

半抗原與N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）一起加入無水四氫呋喃中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐滴加入溶有N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）的無水四氫呋喃溶液，室溫下攪拌反應(yīng)4 h，將反應(yīng)體系置于-20℃冰箱內(nèi)，過濾除去白色沉淀，離心得到白色針狀半抗原活化酯。

將載體蛋白溶于KH2PO4溶液中，同時(shí)將上述半抗原酯化物，溶解于N，N-二甲基甲酰胺（DMF）中，冰浴中逐滴加入至蛋白溶液中，4℃旋轉(zhuǎn)過夜后將反應(yīng)液裝入透析袋，4℃條件下在PBS中緩沖溶液中透析3 d，將透析液冷凍干燥后得到白色粉末，貯于-20℃下備用。

1.4.2 淘選

用無菌水清洗酶標(biāo)板，每次200 μL，共洗滌5次；每孔加入100 μL濃度為10 μg/mL的西維因包被原，4℃過夜；200 μL/孔TBS洗滌3次；分別使用 5%BSA，5%脫脂奶粉和10%脫脂奶粉37℃封閉1h；200μL/孔TBS洗滌5次，加入用TBST稀釋為1010pfu/mL的擴(kuò)增后噬菌體100 μL/孔，室溫放置30 min后4℃過夜；200 μL/孔 PBST 洗滌 20 次，200 μL/孔 TBS 洗 10 次；用200 μL/孔1%SDS洗脫特異性結(jié)合的噬菌體；檢測(cè)洗脫噬菌體滴度，擴(kuò)增后進(jìn)行下一輪淘選。2輪~4輪淘選包被原用量分別為 0.5、0.1、0.02 μg/孔。

1.5 噬菌體克隆的擴(kuò)增及活性檢測(cè)

經(jīng)過4輪淘選，挑取邊界清晰的單克隆噬菌斑，放入50 μL提取緩沖液中，在4℃條件下靜置12 h。以浸取液為模板，利用噬菌體載體引物對(duì)淘選的噬菌體克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR條件為：95℃ 1 min；95℃1 min，50℃1 min，72℃2 min，循環(huán)35次，72℃10 min。

選擇陽性噬菌體克隆進(jìn)行液體擴(kuò)增與滴度測(cè)定。利用直接競(jìng)爭(zhēng)ELSIA檢測(cè)陽性克隆的親和力和特異性：在96孔板中包被109pfu/孔陽性克隆噬菌體，4℃過夜；5%BSA封閉1 h后，分別向同一克隆的平行孔中加入HRP標(biāo)記西維因、HRP標(biāo)記西維因和1 mg/L的西維因農(nóng)藥標(biāo)品，1 h后加入底物顯色。

2 結(jié)果

2.1 抗血清效價(jià)與特異性

經(jīng)過5次腹腔注射免疫后，4只小鼠效價(jià)分別為0、184000、254000、55000，標(biāo)品濃度 5 mg/L 時(shí)抑制率分別為0%、12%、26%和8%，選取特異性較高的第3只小鼠提取脾臟總RNA。

2.2 西維因免疫小鼠脾臟總RNA的提取及mRNA的純化

通過電泳檢測(cè)，總RNA純度較好，其28 S rRNA為18 S rRNA亮度的2倍，表明總RNA完整性較好（圖1 A），電泳檢測(cè)mRNA主要在500 bp以上成彌散狀，表明mRNA完整性較好（圖1 B）。

2.3 scFv擴(kuò)增

利用抗體可變區(qū)的兼并引物，PCR擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為440 bp的輕鏈可變區(qū)片段（圖2 A）和450 bp的VH（圖2 B）。根據(jù)紫外分光度計(jì)算VL和VH濃度分別為15 ng/μL和3 ng/μL，加入等量的輕鏈重鏈進(jìn)行重疊延伸PCR擴(kuò)增scFv，電泳檢測(cè)其長(zhǎng)度約為780 bp（圖3），與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4 抗體庫滴度測(cè)定與擴(kuò)增

經(jīng)過EcoR I和HindⅢ酶切后，將scFv與T7噬菌體臂連接，包裝后構(gòu)建形成抗體庫，經(jīng)過檢測(cè)，原始文庫的庫容為1.74×107pfu，液體擴(kuò)增后滴度為3×1011pfu/mL。

2.5 抗體庫的淘選

以包被原西維因-OVA作為篩選配體，分別使用5%BSA、5%脫脂奶粉和10%脫脂奶粉作為封閉液對(duì)文庫進(jìn)行淘選，經(jīng)過4輪淘選后，3種封閉液獲得噬菌體富集量見圖4。

2.6 淘選后噬菌體的克隆的PCR驗(yàn)證

經(jīng)過4輪淘選隨機(jī)挑選單克隆噬菌斑，用Extraction Buffer提取噬菌體，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，共獲得含有完整scFv片段的克隆14個(gè)。

2.7 噬菌體克隆的ELISA檢測(cè)

直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)14個(gè)陽性克隆進(jìn)行特異性檢測(cè)，其中A4-7和A4-16特異性較好，抑制率分別達(dá)到54.1%和66.4%。

2.8 西維因單鏈抗體的測(cè)序

對(duì)特異性較好的2個(gè)噬菌體克隆進(jìn)行測(cè)序，其中克隆A4-7的輕鏈可變區(qū)由108個(gè)氨基酸構(gòu)成，重鏈可變區(qū)由117個(gè)氨基酸構(gòu)成。克隆A4-16的輕鏈可變區(qū)由112個(gè)氨基酸構(gòu)成，重鏈可變區(qū)由112個(gè)氨基酸構(gòu)成（圖6）。

3 討論

近年來對(duì)噬菌體抗體庫的研究,意在將其應(yīng)用于安全檢測(cè)及醫(yī)療制藥等領(lǐng)域[11]。但目前所獲得的噬菌體抗體親和力較低，因此科研工作者一直努力地通過提高噬菌體抗體庫的庫容和多樣性、優(yōu)化淘選方法及淘選所用抗原等途徑，來獲得親和力高的噬菌體抗體[12]。

抗體種類的豐富性和單鏈抗體基因開放閱讀框的正確性是決定抗體庫質(zhì)量的兩個(gè)關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合成26條輕鏈兼并引物和29條重鏈兼并引物，得到的序列可以反映出免疫過程中抗體分子的多樣性，為構(gòu)建高豐富度抗體庫奠定良好的基礎(chǔ)。利用重疊延伸方法克隆單鏈抗體基因的最大問題是易發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致抗體庫大量克隆不能夠正確展示抗體可變區(qū)，從而大大降低抗體庫的實(shí)效性，本實(shí)驗(yàn)使用了高保真的pfu DNA聚合酶對(duì)片段進(jìn)行重疊延伸連接，并且對(duì)于擴(kuò)增條件進(jìn)行了系列優(yōu)化，以減少移碼錯(cuò)配現(xiàn)象發(fā)生。

得到庫容較高的噬菌體抗體庫后，高效率的篩選過程是活的特異性噬菌體克隆的關(guān)鍵，而篩選效率在很大程度上取決于人工抗原的制備。目前合成的人工抗原普遍存譜寬足夠但特異性不高或者譜寬較窄但是特異性較高的情況[13]，真正達(dá)到兩種結(jié)果一致的情況較少，成為了開發(fā)檢測(cè)試劑盒的主要制約因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬，設(shè)計(jì)檢測(cè)分子共性結(jié)構(gòu)的人工抗原，有針對(duì)的設(shè)計(jì)出合理的抗原結(jié)構(gòu)，通過比較其譜寬和特異性，選擇較好的樣品用于后續(xù)試驗(yàn)，保障了抗體庫的特異性和篩選的效率。T7噬菌體抗體庫的應(yīng)用為人工抗體的制備提供了一種新的途徑，將對(duì)農(nóng)藥殘留免疫檢測(cè)的發(fā)展起到重要的推動(dòng)作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建了西維因特異性抗體庫，庫容為1.74×107pfu。經(jīng)過淘選和ELISA驗(yàn)證，從中篩選到2個(gè)親和性和特異性較為理想的克隆，游離西維因?qū)?個(gè)噬菌體克隆的抑制率分別達(dá)到54.1%和66.4%。經(jīng)過序列測(cè)定，2個(gè)克隆的輕鏈可變區(qū)分別由108和112個(gè)氨基酸構(gòu)成，重鏈可變區(qū)分別由117和112個(gè)氨基酸構(gòu)成。本研究為西維因基因工程抗體的制備與應(yīng)用提供了良好的參考。

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Construction of Phage ScFv Library Against Carbaryl and Selection of Specific Phage Clones

WANG Shuo,LIU Xin-yu,WU Yi-na,DU Xin-jun,ZHU Chao,ZHANG Jie
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

2011-12-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20905058，31071547）

王碩（1969—），男（漢），教授，博士，主要從事食品安全研究。