郭靈安，雷紹榮，仲伶俐，胡莉，梁立，毛建霏

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，四川成都610066）

UPLC-MS/MS 法分析茶葉中的滅多威農(nóng)藥殘留

郭靈安，雷紹榮，仲伶俐，胡莉，梁立，毛建霏

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，四川成都610066）

建立了檢測(cè)茶葉中滅多威殘留的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS－MS）分析方法。茶葉樣品經(jīng)乙腈提取，氨基固相萃取柱凈化，反相液相色譜對(duì)樣品進(jìn)行分離，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行定性、定量分析。結(jié)果表明：方法檢出限為 0.5 μg/kg，定量限為 2.0 μg/kg；當(dāng)添加濃度水平為 10、100 μg/kg 時(shí)，加標(biāo)回收率為 71.9%～113.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.3%～12.5%。該法靈敏度高、干擾小、定性準(zhǔn)確，適用于茶葉中滅多威殘留檢測(cè)，同時(shí)可作為液相色譜檢測(cè)的驗(yàn)證方法。

UPLC-MS/MS；茶葉；滅多威；殘留

Abstract:A method was developed for the determination of methomyl residues in tea with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS-MS).The methomyl residues in tea samples were extracted with acetonitrile,the extract was cleaned up by amino solid phase extraction column,then separated by reversed phase liquid chromatography,and determined by UPLC-MS-MS in the multiple reaction monitoring mode.The results showed that:the LOD is 0.5 μg/kg,LOQ is 2.0 μg/kg;when the added level was 10,100 μg/kg,the recovery was from 71.9%-113.5%,and the relative standard deviation was from 5.3%-12.5%.The method can be used as the detection method and also the verification method for HPLC of Methomyl residues in tea,because of high sensitivity,low interference,and accurate qualitative.

Key words：UPLC-MS/MS;tea;methomyl;residues

近日，茶葉中農(nóng)藥殘留超標(biāo)和使用違禁藥物的報(bào)道備受關(guān)注，消費(fèi)者對(duì)食品安全問題再度產(chǎn)生熱議。媒體報(bào)道國(guó)際環(huán)保組織（綠色和平）調(diào)查報(bào)告稱，有多個(gè)國(guó)產(chǎn)品牌茶葉含有國(guó)家明令禁止在茶葉上使用的農(nóng)藥滅多威。滅多威被世界衛(wèi)生組織（WHO）定義為劇毒農(nóng)藥，中毒癥狀有頭暈頭痛，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)血壓下降或意識(shí)不清，長(zhǎng)期暴露于該農(nóng)藥中會(huì)破壞人的內(nèi)分泌系統(tǒng)。滅多威是20世紀(jì)60年代中期出現(xiàn)的氨基甲酸酯類（NMCs）殺蟲劑。該類農(nóng)藥是以甲酸酯為前體化合物發(fā)展而來(lái)的，具有分解快、殘留期短、低毒、高效、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，在農(nóng)作物保護(hù)中的使用越來(lái)越廣泛[1-3]。

伴隨生活水平和健康意識(shí)的提高，人們?cè)絹?lái)越重視農(nóng)藥殘留問題。早在2011年9月與12月，歐盟兩次出臺(tái)法規(guī)，強(qiáng)化對(duì)中國(guó)輸歐茶葉的口岸抽檢力度。此外，歐盟近年密集出臺(tái)茶葉農(nóng)殘限量標(biāo)準(zhǔn)，使得輸歐茶葉市場(chǎng)準(zhǔn)入資格日益嚴(yán)苛，農(nóng)殘檢出率大大提升。歐盟對(duì)農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)的高要求，也導(dǎo)致了中國(guó)茶葉出口受到影響。

隨著農(nóng)藥殘留分析方法的發(fā)展與進(jìn)步，人們已經(jīng)對(duì)不同介質(zhì)（如水、水果、蔬菜、小麥、煙草、茶葉等）中氨基甲酸酯類農(nóng)藥測(cè)定進(jìn)行了相關(guān)的研究[2-12]。其中，茶葉基質(zhì)的檢測(cè)方法有氣相色譜法和液相色譜柱后衍生熒光法[11-12]，較為普遍的是液相色譜柱后衍生熒光法，其不足在于衍生試劑易氧化失效造成衍生效果不穩(wěn)定，影響檢測(cè)結(jié)果。而且茶葉復(fù)雜基質(zhì)中大量干擾成分使液相色譜的分離也存在一定的困難，影響定性的準(zhǔn)確性。LC-MS-MS是快速發(fā)展的一種分析技術(shù)，具有很高的靈敏度和分離能力，近年來(lái)在水果、蔬菜等農(nóng)殘分析上已有了一些應(yīng)用，但在茶葉中農(nóng)殘分析的應(yīng)用還鮮有報(bào)道。因此，建立一個(gè)茶葉中滅多威殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS－MS）分析方法對(duì)于茶葉復(fù)雜基質(zhì)中微量農(nóng)藥殘留的檢測(cè)實(shí)屬必要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉為干樣，粉碎備用；滅多威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度1000 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心）；甲醇（HPLC，美國(guó) SIGMA-ALDRICH）；乙腈（HPLC，美國(guó) SIGMA-ALDRICH）；二氯甲烷（HPLC，美國(guó) Honeywell Burdick&Jackson）；氯化鈉（AR，汕頭市西隴化工廠有限公司）；氨基固相萃取柱（6 mL，500 mg，美國(guó) Agilent Accubond NH2）；試驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Xevo TQ超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國(guó)Waters；R-210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)BUCHI；培英THZ-C恒溫振蕩器：大倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；DT-1002A電子天平：常熟市金羊砝碼儀器有限公司；微孔濾膜：0.22 μm，天津津騰；實(shí)驗(yàn)室超純化水機(jī)：艾科浦，ACD1-2005-U。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

吸取滅多威標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度1000 μg/mL）1mL于10 mL刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成100 μg/mL的滅多威標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。移取0.1 mL該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL刻度試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1.0 μg/mL的滅多威標(biāo)準(zhǔn)工作液。上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)使用液用前根據(jù)需要用甲醇、水的混合溶液（50+50）稀釋成適當(dāng)濃度?；|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)使用液用陰性空白樣品溶液稀釋成適當(dāng)濃度。

1.3.2 樣品制備和提取

稱取5 g試樣（精確至0.01 g）于磨口錐形瓶中，加入20 mL水，振搖，使茶葉充分潤(rùn)濕，靜置溶脹20 min，加入50 mL乙腈提取液，置于振蕩器上振蕩1 h，過濾，濾液收集到裝有約5 g氯化鈉（氯化鈉用前于140℃烘烤4 h）的50 mL具塞量筒中，蓋上塞子，震搖1 min，室溫（25℃）靜置2 h。吸取10 mL上層清液（乙腈相）于100 mL梨形瓶中，40℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，加入3.0 mL淋洗液（甲醇+二氯甲烷=5+95）溶解殘?jiān)?，蓋上塞子待凈化。

1.3.3 SPE凈化

將氨基SPE小柱用4.0 mL淋洗液預(yù)淋洗，棄去淋洗液，當(dāng)液面快到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，將待凈化樣品溶液轉(zhuǎn)移至SPE小柱中，收集流出液于50 mL梨形瓶中，再用淋洗液洗滌裝樣液的梨形瓶3次（3+2+2 mL），并轉(zhuǎn)至SPE小柱，合并淋洗液。淋洗液于30℃水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，洗耳球吹干，用甲醇、水的混合溶液（50+50）準(zhǔn)確定容至2.0 mL，渦旋使之溶解完全，用0.22 μm的濾膜過濾，待測(cè)。

添加回收實(shí)驗(yàn)前處理同空白樣品。即將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加到樣品，靜置0.5 h后以同樣的方法提取凈化。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：Waters BEH C8（2.1 mm ×50 mm,1.7 μm）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動(dòng)相 A：水，流動(dòng)相B：甲醇+乙腈=1+1，梯度洗脫，流動(dòng)相梯度見表1。

表1 流動(dòng)相梯度表Table 1 The mobile phase gradient table

1.3.5 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子模式（ESI＋）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；毛細(xì)管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150℃；錐孔氣流速：50 L/h；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣流量：700 L/h。質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見表2。

表2 滅多威質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of methomyl

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道的提取溶劑有丙酮、石油醚、丙酮/水[2]混合溶劑等。但茶葉基質(zhì)成分多，用丙酮提取時(shí)，提取出的雜質(zhì)較多，易造成基質(zhì)干擾。而用乙腈提取，雜質(zhì)少，凈化后樣品干凈，分析結(jié)果的靈敏度、準(zhǔn)確度更高。本研究選擇乙腈作為提取溶劑。

2.1.2 提取條件的優(yōu)化

茶葉樣品提取液濃縮時(shí)易產(chǎn)生暴沸，導(dǎo)致樣品損失，回收率低。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，提取前需加入足夠量的水分使之充分潤(rùn)濕，并放置一段時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)中確定，稱取5 g樣品量時(shí)，加入20 mL水潤(rùn)濕樣品能夠明顯減少暴沸的發(fā)生。同時(shí)為了保證茶葉中農(nóng)藥提取充分，將提取溶劑體積確定為樣品質(zhì)量的10倍。

2.1.3 凈化條件的選擇

氨基SPE柱的主要作用力是極性陰離子交換，與極性化合物有較的強(qiáng)結(jié)合能力，能將樣品中的滅多威殘留吸附在填料上，最后用中等極性洗脫體系（甲醇+二氯甲烷=5+95）將分析物洗脫下來(lái)，色素等雜志保留在SPE小柱上，從而達(dá)到凈化、濃縮的目的。

2.2 儀器條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)以往研究經(jīng)驗(yàn)初步確定色譜條件，并進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)中采用梯度洗脫，能得到比等度條件下更窄的峰形，而且一定時(shí)間高濃度有機(jī)溶劑的洗脫能夠減少色譜柱中雜質(zhì)的殘留，有利于延長(zhǎng)色譜柱的壽命。

2.2.2 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

滅多威極性較大，易離子化，適合采用ESI源。其含有的氨基甲?；?OCONHCH3是一個(gè)給電子基團(tuán)，容易得到一個(gè)質(zhì)子，故容易在正離子模式下得到更多的離子，獲得響應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)采用直接進(jìn)樣方式，在ESI+模式下找到母離子，然后通過調(diào)節(jié)碰撞能量選擇2個(gè)相對(duì)豐度較高的特征離子作為定量離子和定性離子（如表2所示）。分析時(shí)再結(jié)合化合物保留時(shí)間等信息，進(jìn)行定性、定量分析。滅多威標(biāo)準(zhǔn)樣品及樣品加標(biāo)離子色譜圖見圖1、圖2。

從茶葉空白樣品加標(biāo)色譜圖（圖2）可以看出，在串聯(lián)四級(jí)桿多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下進(jìn)行檢測(cè)，所選的定量離子和定性離子具有很高的特異性，經(jīng)過SPE小柱凈化處理后的樣品對(duì)滅多威目標(biāo)物質(zhì)的分析基本不存在干擾。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的影響探討

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)普遍存在基質(zhì)效應(yīng)問題，當(dāng)樣品中的共提取物與被測(cè)物一同進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，將在一定程度上影響被測(cè)物的離子化過程，造成響應(yīng)信號(hào)的抑制或提高[9]。本文對(duì)純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行比較，結(jié)果顯示：茶葉基質(zhì)對(duì)滅多威農(nóng)藥的離子化有明顯的抑制作用，使得滅多威在樣品基質(zhì)中的質(zhì)譜響應(yīng)值降低了很多，如圖3所示。所以，在定量分析中，要獲得較為準(zhǔn)確的分析結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液必須在同樣的基質(zhì)條件下進(jìn)行分析，即用空白茶葉基質(zhì)配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)樣品進(jìn)行定量，以盡可能地消除或有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.3 方法檢出限、定量限及添加回收試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)分別以儀器3倍信噪比和10倍信噪比求得方法檢出限達(dá)0.5 μg/kg，定量限達(dá)2.0 μg/kg。選取2個(gè)茶葉樣品進(jìn)行檢測(cè)，并做了加標(biāo)回收試驗(yàn)。添加水平及回收率結(jié)果見表3。

表3 滅多威添加回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 The spiked recoveries and RSD of methomyl(n=3)

分析結(jié)果表明，所選特征離子反映出了分析物質(zhì)的主要特征，靈敏度高，選擇性好，定量分析準(zhǔn)確。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)證明，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析茶葉中的滅多威農(nóng)藥?kù)`敏度高、干擾小，定性準(zhǔn)確，相對(duì)液相色譜熒光柱后衍生法也更加簡(jiǎn)便，尤其是對(duì)微量殘留檢測(cè)具有很大的優(yōu)勢(shì)。該法適用于茶葉中的滅多威殘留檢測(cè)，同時(shí)可作為液相色譜檢測(cè)的驗(yàn)證方法。但需要注意的是，茶葉基質(zhì)復(fù)雜，基質(zhì)對(duì)電離有明顯的抑制作用，如果用試劑標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，回收率低，結(jié)果不可靠。因此在定量分析時(shí)，必須用基質(zhì)空白配制標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量分析，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。另外，測(cè)定樣品的定容溶劑用甲醇和水的混合溶液可以降低溶劑效應(yīng)，使色譜峰形得到改善，有利于準(zhǔn)確定量。

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Analysis of Methomyl Pesticide Residues in Tea by UPLC-MS/MS

GUO Ling-an,LEI Shao-rong,ZHONG Ling-li,HU Li,LIANG Li,MAO Jian-fei
（Analysis and Testing Center of Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Food Quality Inspection and Supervision Center of Agricultural Ministry,Chengdu 610066,Sichuan,China）

2012-04-24

郭靈安（1962—），男（漢），副研究員，學(xué)士，研究方向：食品質(zhì)量安全。