崔曉霞，張小麗，羅書勤，張力平

北京林業(yè)大學材料科學與技術學院，北京，100083

原花青素是1967年美國人最早從葡萄皮和葡萄籽中提取分離出4種多酚化合物，得到的多酚化合物在酸性介質中加熱均可產(chǎn)生花青素(cyanidins)，故將這類多酚化合物命名為原花青素［1］(Proanthocyanidins，PC)。有人將其歸為生物類黃酮，也有人將其歸為縮合鞣質。原花色素是植物體內生成的復雜多酚類物質，原花青素為其中分布最廣、數(shù)量最多的一種［2］。原花青素廣泛分布于植物界，如葡萄、蘋果等水果中和山楂的皮、核、梗以及黑荊樹、松樹皮、銀杏、野生刺葵、番荔枝等植物中，也存在于某些飲料(茶葉、啤酒)、蔬菜和糧食中，與人類生活和健康密切相關［3-5］。原花青素具有多種化學與生物活性，如抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏和保護心血管和預防高血壓、抗腫瘤和抗輻射等功能，在食品、保健品、化妝品及醫(yī)藥等領域具有廣泛的應用前景［6］。

落葉松屬松科落葉松屬植物，分布于我國東北，為大、小興安嶺海拔300～1200 m地帶的主要林木，俄羅斯(遠東地區(qū))也有分布。樹皮中含有豐富的原花青素類化合物［7-9］，是一種極具利用價值的綠色資源。為了充分利用落葉松樹皮資源，確定其最佳的活性物質原花青素的提取工藝，本文以落葉松樹皮為原料，采用超聲提取法對原花青素的提取工藝進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

原料:落葉松樹皮由內蒙古拓孚林化有限責任公司提供。

試劑:原花青素標準品，含量≥95%，天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司;色譜甲醇，J.T.Baker(USA);無水乙醇、鹽酸、正丁醇、十二水合硫酸鐵銨，均為分析純，北京化工廠。

儀器設備:旋轉蒸發(fā)器，RE52CS-1型，上海亞榮生化儀器廠;紫外可見分光光度計，UV-1801型，北京瑞利分析儀器公司;數(shù)控超聲波清洗器，KQ5200DB型，昆山市超聲儀器有限公司;全自動精密分析天平，TG328A型，上海精密科學儀器有限公司;電熱恒溫鼓風干燥箱，DHG-9030A型，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 落葉松樹皮中原花青素的提取方法

將落葉松樹皮粉碎至30～40目，準確稱取20 g于500 mL錐形瓶中，加入200 mL一定濃度的乙醇溶液浸泡24 h，在一定的料液比、乙醇濃度和提取溫度下超聲提取一段時間，取出真空抽濾，濾液經(jīng)減壓濃縮后置于30℃鼓風干燥箱內干燥，得到原花青素粗品。研究料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時間對原花青素提取率的影響。并以乙醇濃度、超聲時間、料液比、提取溫度設計L9(34)正交試驗(見表1)，探討最佳工藝條件。為了提高試驗精度，每組實驗均重復兩次。

表1 正交實驗的因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2 標準溶液

精確稱取原花青素標準品，用甲醇溶解定容，配制成0.00、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL的標準系列溶液，分別取1 mL各種濃度的標準溶液于10 mL的具塞試管中，依次加入0.2 mL 2%的鹽酸-硫酸鐵銨溶液、6 mL正丁醇－鹽酸溶液，混合均勻后在95℃的熱水中加熱反應40 min，取出后立即冷卻至室溫。以甲醇溶液為空白，用紫外分光光度計在546 nm處測定其吸光度值，繪制原花青素標準溶液的標準曲線圖，見圖1。對標準曲線樣點進行線性擬合，得到標準曲線回歸方程:y=2.636x-0.0026 ，R2=0.9992，其中 x 為濃度(mg/mL)，y 為吸光度，R2為相關性因數(shù)。

圖1 Bate-Smith法標準曲線Fig.1 the standard curve of the Bate-Smith analysis method

1.2.3 原花青素含量測定

準確稱取10 mg原花青素用適量甲醇溶解，定容至50 mL。取上述溶液1 mL于10 mL具塞試管中，依次加入0.2 mL 2%的鹽酸-硫酸鐵銨溶液、6 mL正丁醇－鹽酸溶液，混合均勻后于95℃的熱水中反應40 min，取出后立即冷卻至室溫。以甲醇溶液作為空白，用紫外分光光度計在546 nm處測得其吸光度值。并根據(jù)回歸方程計算待測液中的原花青素的含量，其公式為:

式中:Ym為原花青素的得率，%;m1為原花青素粗提物的質量，g;m2為落葉松樹皮的質量，g;w為落葉松樹皮的含水率，%;X為被測樣品原花青素的含量，%;A為吸光度值;T為原花青素的提取率，%。

2 結果與討論

2.1 反應條件對原花青素提取率的影響

2.1.1 料液比對原花青素提取率的影響

圖2 料液比對超聲提取的影響Fig.2 Effects of solvent to material ratio on ultrasonic extraction

由圖2可知，隨著料液比的增大，原花青素的提取率呈先上升后下降的趨勢。提取溶劑的用量越大，其提取效率則越好。但是，在一定量的提取溶劑中，原花青素已經(jīng)全部溶出，再增加提取溶劑的用量并不能提高提取率，這是因為溶劑過多時，超聲波的能量對沉淀底層的落葉松樹皮顆粒的空化效應和機械效應的強度減弱，影響超聲提取的效果。因此選擇最佳料液比為1∶15。

2.1.2 乙醇濃度對原花青素提取率的影響

圖3 乙醇濃度對超聲提取的影響Fig.3 Effects of ethanol concentration on ultrasonic extraction

由圖3可知，隨著乙醇濃度的提高，原花青素的提取率增大，當乙醇濃度為50%時提取率達到最大值。水是典型的強極性溶劑，介電常數(shù)很大，而乙醇的極性相對要弱一些，調節(jié)乙醇和水的配比能夠調節(jié)萃取溶劑的極性。原花青素為極性化合物，根據(jù)相似相溶原理，選擇適宜的乙醇和水的配比可以提高原花青素的提取率和純度。

圖4 提取溫度對超聲提取的影響Fig.4 Effects of extraction temperature on ultrasonic extraction

2.1.3 提取溫度對原花青素提取率的影響由

圖4可知，隨著溫度的升高，原花青素的提取率呈先上升后下降的趨勢，當溫度為35℃時，提取率達到最大值。溫度升高會提高物質的溶出，但如果進一步升高，則會導致原花青素氧化分解，雜質溶出量增加，影響提取效率。因此，選擇35℃為落葉松樹皮原花青素的最佳提取溫度。

2.1.4 超聲時間對原花青素提取率的影響

圖5 超聲時間對超聲提取的影響Fig.5 Effects of extraction time on ultrasonic extraction

由圖5可知，超聲時間較短時，原花青素不易溶出，隨著超聲時間的延長原花青素的提取率也會隨之提高，超聲時間為30 min時提取率達到最高。但是隨著超聲時間的增加，落葉松樹皮內外組分濃度逐漸趨于平衡，物質難以溶出，而且提取時間的延長還會導致其受熱時間過長而變性，從而導致提取率下降，因此確定最佳超聲波作用時間為30 min。

2.2 正交實驗

按1.2.1所述L9(34)正交實驗設計因素水平安排，考察松樹皮中原花青素的提取效果。實驗結果及分析見表2。

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

由表2可知，乙醇濃度、超聲時間、料液比和提取溫度等四個因素對原花青素的提取效果均有顯著影響。對落葉松樹皮中原花青素提取率影響的主次順序為:D＞B＞A＞C，即提取溫度＞提取時間＞乙醇濃度＞料液比，且A1B1C1D3為最佳方案，即乙醇濃度為50%，超聲提取時間為0.5 h，料液比取1∶15，提取溫度為35℃。

2.3 落葉松樹皮原花青素含量的測定

按照1.2.3的方法測定落葉松樹皮原花青素粗品的含量，其紫外分析結果如圖6所示。

圖6 落葉松樹皮超聲提取物的紫外光譜圖Fig.6 UV absorption spectrum of larch bark OPC by ultraphonic

根據(jù)文獻報道［10］，正丁醇-鹽酸法測定原花青素的原理是基于其花色素反應，即原花青素在熱酸作用下能產(chǎn)生紅色物質，從而可用分光光度法進行測定。對于單體原花青素黃烷-3，4-二醇來說，C-4位具有極強的親電性，其醇羥基與C-5，C-7上的酚羥基組成一個芐醇系統(tǒng)，使得4位碳易于形成正碳離子。在強酸作用下，正碳離子失去質子，氧化生成花色素。對于聚合原花青素，其單元間連接鍵易在酸作用下被打開，下部單元生成黃烷-3-醇，上部單元生成花色素。落葉松樹皮原花青素粗品的紫外分析結果表明，落葉松樹皮的提取物在正丁醇-鹽酸體系中熱后成為紅色，即發(fā)生了花色素反應，而且在546nm處出現(xiàn)明顯的紫外吸收峰，由此可以初步判斷出落葉松樹皮中含有原花青素。

3 結論

本文研究了料液比、乙醇濃度、提取溫度、超聲時間對原花青素提取率的影響，并利用正交實驗對落葉松樹皮原花青素的提取工藝進行了研究，通過結果分析及實際生產(chǎn)考慮確定的最佳提取工藝為:乙醇濃度為50%，超聲提取時間為0.5 h，料液比取1∶15，提取溫度為35℃，其提取率為17.52%。紫外分析表明，落葉松樹皮提取物在熱酸作用下在546 nm左右具有特征吸收峰，即本實驗提取出的落葉松樹皮提取物中含有原花青素成分。

1 Celestino SB，Augustin S.Proanthocyanidins and tannin-like compounds-nature，occurrence dietary intake and effects on nutrition and health.J Sci Food Agric，2000，80:1094-1117.

2 Sun DW(孫達旺).植物單寧化學.北京:中國林業(yè)出版社，1992:130-142.

3 Porter L，Hrstich L，Chan B.Photochemistry，1986，25:223-230.

4 Lee YA，Cho EJ，Yokozawa T.Effects of Proanthocyanidin Preparations on Hyperlipidemia and Other Biomarkers in Mouse Model of Type 2 Diabetes.2008，J Agric Food Chem，56:7781-7789.

5 Zhang ZS(張澤生)，Zhao CY(趙春艷)，Xu Y(徐英)，et al.Study on extracting procedure of proanthocyanidins form hawthorn fruit.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2007，19:127-130.

6 Shrikhande Anil J.Wine by-products with health benefits.Food Res Inter，2000，33:469-474.

7 Mun SP，Ku CS.Characterization of low molecular weight polyphenols from pine(Pinus radiata)bark.Food Sci Biotechnol，2006，15:424-430.

8 Chang Sub Ku，Sung PhilMun.Characterization of proanthocyanidin in hot water extract isolated from Pinus radiate bark.Wood Sci Technol，2007，41:235-247.

9 Li BY，Cheng M，Gao HQ，et al.Back-regulation of six oxidative stress proteins with grape seed proanthocyanidin extracts in rat diabetic nephropathy.J Cell Biochem，2008，104:668-679.

10 Bate-Smith，E.C.Phytochemistry of proanthocyanidins.1975，Phytochemistry，14:1107-1113.