郭春梅，劉淑清，孫明忠*

1大連醫(yī)科大學(xué)生物技術(shù)系;2大連醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，大連 116044

蛇毒(snake venom，SV)是由生物活性多肽、蛋白(酶)、核苷和金屬離子等組成的混合物，是自然界中最豐富最集中的蛋白(酶)源之一。SV蛋白(酶)具有抗凝止血、鎮(zhèn)痛、影響血小板聚集、誘導(dǎo)出血或溶血、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、刺激水腫形成、抗病毒、抗腫瘤、抗菌消炎、抗HIV活性等多種生物學(xué)活性。從各類SV中得到的蛋白(酶)，已被廣泛作為基礎(chǔ)理論研究的工具酶，以及臨床血液類疾病藥物、神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛藥、抗癌藥物、止血類藥物和降壓類藥物，此外，蛇毒組分還被應(yīng)用于艾滋病防治和異種心臟移植排斥作用研究中。目前研究較多的SV組分是:神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、類凝血酶、纖溶酶源激活物、磷脂酶 A2和 L-氨基酸氧化酶［1-7］。

L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO，EC 1.4.3.2)是一種典型的核黃素酶，多為由兩個(gè)約60 kDa相同亞基組成的二聚體分子，能專一性催化氧化L-氨基酸，生成相應(yīng)的(α-酮酸和氨，并釋放過氧化氫(H2O2)(Fig.1)。LAAO廣泛存在于細(xì)菌、真菌、藻類和動(dòng)植物中，與氮源利用和轉(zhuǎn)化有關(guān)。SV-LAAO在蝰科、響尾蛇科以及眼鏡蛇科中廣泛分布，含量高、酶活性強(qiáng)(比哺乳動(dòng)物酶活性高400多倍)，易純化，便于研究。SV-LAAO通常是黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)或黃素單核苷酸(FMN)結(jié)合的糖蛋白同源二聚體分子，通過催化氧化L-氨基酸產(chǎn)生H2O2，與蛇毒活性和毒性密切相關(guān)［1-7］。不同蛇毒LAAO在分子量、穩(wěn)定性、底物特異性、與血小板作用、誘導(dǎo)出血、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抗菌活性等方面差異很大［1，7-9］。在 20 世紀(jì) 90 年代前，對(duì) SVLAAO研究局限于酶學(xué)和生化性質(zhì)［7］，被用來確證氨基酸的光學(xué)異構(gòu)體、由L-氨基酸制備α-酮酸和由3，5-二碘酪氨酸生產(chǎn)甲狀腺素［1，6，8-12］。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，SV-LAAO具有調(diào)控血小板聚集、刺激水腫形成、誘導(dǎo)出血或溶血、抗病毒、抗菌消炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗病毒/HIV活性以及抗寄生蟲活性等，具有潛在的巨大藥物開發(fā)價(jià)值和臨床應(yīng)用前景，從而重新獲得了研究者的青睞。

本文主要綜述了近10年來SV-LAAO在影響血小板聚集、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞毒性、抑菌活性和抗病毒/HIV活性等方面的獨(dú)特生物學(xué)作用及其相關(guān)作用機(jī)制。

圖1 LAAO的催化反應(yīng)Fig.1 Reaction catalyzed by LAAO

1 SV-LAAO酶學(xué)特性

LAAO在蛇毒中約占蛇毒總蛋白的1% ～9%，含量最為豐富的是響尾蛇，其次是蝰蛇科和眼鏡蛇科［12，17，18］。海蛇中存在這種酶，但活性低。不同蛇毒LAAO的活性、含量及同工酶譜差異很大。

大多數(shù)SV-LAAOs呈現(xiàn)熱不穩(wěn)定性;SV-LAAO失活也與緩沖液離子強(qiáng)度和pH有關(guān)，反復(fù)凍融會(huì)影響酶活性。一般在4℃、中性pH條件下可長(zhǎng)期保持SV-LAAO活性。在－5℃ ～－60℃會(huì)使酶失活，最易失活溫度為 －20 ℃［3，19-21］。不同 SV-LAAO對(duì)溫度敏感性不同，在50℃以上一般可使所有SVLAAOs失活;Agkistrodon halys blomhoffii LAAO在－80℃保存6個(gè)月仍保持其活性［12］。pH值改變也會(huì)引起 SV-LAAO失活，多數(shù)情況下，失活 SVLAAO在pH 5.0條件下加熱恢復(fù)活性;一價(jià)陰離子如氯離子可延緩其失活［19，20，22］。Naja naja oxiana LAAO(NA-LAAO)可經(jīng)受冷凍而保持活性，但反復(fù)凍融會(huì)影響其結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響其與血小板的相互作用［18］。Apoxin I在70°C保溫10 min或反復(fù)凍融，會(huì)消除酶活性和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性［23］。在 SVLAAO失活過程中其輔基FAD仍然存在，但其吸收光譜及旋光色散光譜會(huì)產(chǎn)生細(xì)小變化，其失活可能由FAD構(gòu)象變化所致。由于 FAD的存在，SVLAAO在465、380和280 nm處有典型特征吸收峰［1，13，14，24-26］。SV-LAAO 失活伴隨 FAD 最大吸收峰波長(zhǎng)遷移，可根據(jù)此變化判斷酶的失活。

多數(shù)SV-LAAOs對(duì)疏水性和芳香族氨基酸有很高親和力，如苯丙氨酸(L-Phe)、色氨酸(L-Trp)、纈氨酸(L-Ile)、蛋氨酸(L-Met)和亮氨酸(LLeu)［7，16，27］。Ophiophagus Hannah LAAO 最適底物為 L-Lys，Bungarus fasciatus LAAO(BF-LAAO)最適底物為 L-Asp 和 L-Glu［28］。

不同SV-LAAO底物結(jié)合特異性差異源自結(jié)合位點(diǎn)的不同，其催化差異可能因?yàn)槠鋫?cè)鏈結(jié)合位點(diǎn)不同造成。一般認(rèn)為SV-LAAO有一個(gè)氨基酸側(cè)鏈結(jié)合位點(diǎn)，由3-4個(gè)疏水的亞位點(diǎn)組成;而O.hannah LAAO還有另一結(jié)合位點(diǎn)用來結(jié)合LLys［16，26-28］。

2 SV-LAAO結(jié)構(gòu)特征

2.1 SV-LAAO基本結(jié)構(gòu)特征

SV-LAAO通常是通過非共價(jià)鍵結(jié)合的同源二聚體糖蛋白［7，19-21］，BF-LAAO 則被報(bào)道是一個(gè)單體蛋白［28］。SV-LAAO等電點(diǎn)(pI)差別很大，在 4.4-8.5 間;并存在同功酶。Bothrops jararaca［8］，Bothrops alternatus［14］，Pseudechis australis，Vipera berus berus［20］和 Agkistrodon blomhoffii ussurensis［29］蛇毒中存在LAAO同功酶現(xiàn)象。另外，一種蛇毒中可同時(shí)含有酸性、堿性和中性的LAAOs，這主要由蛋白翻譯后修飾所致或者由不同基因合成而來。SV-LAAO酸堿度不同是否呈現(xiàn)不同藥理學(xué)特性，尚需深入研究闡明。

Crotalus adamanteus，Crotalus atrox，Calloselasma rhodostoma，Agkistrodon halys blomhoffii，Trimeresurus stejneggeri和Bothrops moojeni六種蛇毒的LAAOs的cDNA被克隆和分析，它們的氨基酸序列相似性＞80%［1］。但SV-LAAO氨基酸序列與細(xì)菌、真菌的LAAO序列相似性很小，僅在FAD結(jié)合位點(diǎn)區(qū)域上與人單胺氧化酶、細(xì)菌和真菌的LAAOs具較高序列相似性;SV-LAAO和白介素4誘導(dǎo)的大鼠Fig.1蛋白序列相似性稍高，大于30%。

Calloselasma rhodostoma和Agkistrodon halys pallas LAAOs晶體結(jié)構(gòu)表明，LAAO和D-氨基酸氧化酶(DAAO)底物結(jié)合位點(diǎn)是對(duì)映體關(guān)系［7，21］。Calloselasma rhodostoma蛇毒的LAAO功能性結(jié)構(gòu)是雙體形式，每一單體包括三個(gè)結(jié)構(gòu)域:FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)域。SV-LAAO底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)底物進(jìn)入并與活性位點(diǎn)結(jié)合的通道，允許底物進(jìn)入和產(chǎn)物釋放［3，26，30，31］;SV-LAAO 的 FAD 結(jié)合結(jié)構(gòu)域與人類、細(xì)菌和真菌的相似，對(duì)酶活性非常重要。

2.2 SV-LAAO是糖基化蛋白

多數(shù) SV-LAAOs是糖蛋白［3，31］。Calloselasma rhodostoma LAAO 結(jié)構(gòu)表明［3，31］:該酶有 Asn 172 和Asn 361兩個(gè)N-糖基化位點(diǎn);Geyer確定連接糖鏈為唾液酸，其在該LAAO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗菌等方面起重要作用［31］。Torii等人發(fā)現(xiàn)apoxin 1去除糖鏈后其催化活性完全消失［23］;采用PNGase F去除糖基后，Agkistrodon halys pallas LAAO活性降低75%，說明糖基化在調(diào)節(jié)酶活和生物活性中起作用［32］。但糖基去除對(duì)來源于 Bothrops Pauloensis［1］，Bothrops jararaca［8］，Bothrops alternatus［14］和 Bothrops moojeni［24］蛇毒的LAAO活性無影響，不是生物活性必需的。因此，SV-LAAO糖基化的具體作用，其是否具有特異性，有待進(jìn)一步研究。

2.3 SV-LAAO是金屬離子結(jié)合蛋白

本課題組從Agkistrodon blomhoffii Ussurensis蛇毒得到了Akbu-LAAO［29］，采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)［29，33-36］發(fā)現(xiàn) Akbu-LAAO是含Zn2+蛋白，每個(gè)二聚體蛋白含有4個(gè)Zn2+，首次報(bào)道了SV-LAAO是金屬離子結(jié)合蛋白。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Zn2+的去除不影響Akbu-LAAO的水解活性，但可導(dǎo)致其構(gòu)象改變而使Akbu-LAAO最大發(fā)射熒光強(qiáng)度降低61%。Zn2+對(duì)Akbu-LAAO水解活性不是必需的，但有助于保持Akbu-LAAO結(jié)構(gòu)完整性。另外，某些外源金屬離子Mg2+、Mn2+、Ca2+、Ce3+、Nd3+、Co2+和 Tb3+可顯著提高 Akbu-LAAO 水解L-Leu活性，其中Tb3+影響效果最強(qiáng)，使 Akbu-LAAO水解活性提高約2倍，Mg2+增加其50%的水解活性;Ni2+、La3+、Gd3+、Fe2+、Cu2+和 Eu2+/Eu3+對(duì)Akbu-LAAO水解L-Leu活性影響不明顯［29］。

3 SV-LAAO的生物學(xué)活性

3.1 對(duì)血小板作用

心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，死亡率居首位?？寡“逯委熓窃擃惣膊》乐蔚囊粋€(gè)重要方面，但目前此類臨床藥物少且具有副反應(yīng)。SV-LAAO對(duì)血小板有明顯作用［1，10-14，17，18，22，25，29，32，37］，但其對(duì)血小板的作用存在爭(zhēng)鳴:有些SV-LAAOs抑制由誘導(dǎo)劑引起的血小板聚集，而有些SV-LAAOs則能誘導(dǎo)血小板聚集。不同來源SV-LAAO對(duì)血小板聚集相反的作用可能由酶活性高低差異導(dǎo)致，但目前尚無人對(duì)其活性作出統(tǒng)一性比較。一般認(rèn)為H2O2在SV-LAAO對(duì)血小板作用中發(fā)揮重要作用，歷來是該領(lǐng)域研究重點(diǎn)。

3.1.1 SV-LAAO對(duì)血小板聚集的促進(jìn)作用

Bothrops Pauloensis［1］，Trimeresurus jerdonii［11］，Trimeresurusmucrosquamatus［13］， Bothropsalternatus［14］，Eristocophis macmahoni［17］，Bothrops atrox［22］，Crotalus durissus cascavella(Casca LAAO)［25］和 O.Hannah蛇毒 LAAOs能促進(jìn)血小板聚集。Casca LAAO促進(jìn)人血小板聚集，并呈劑量相關(guān)性;Pignatelli等人認(rèn)為ADP和凝血酶不會(huì)激發(fā)H2O2的形成，但H2O2卻參與膠原(collagen)誘導(dǎo)的血小板聚集;二者促進(jìn)血小板聚集作用被過氧化氫酶(catalase)消除，即其誘導(dǎo)的血小板聚集需要環(huán)氧合酶的參與，而H2O2可能作為第二信使在血小板聚集過程中發(fā)揮作用。O.hannah蛇毒LAAO能誘導(dǎo)富含血小板血漿發(fā)生血小板聚集，該作用不依賴于ADP釋放。也有研究表明SV-LAAO促進(jìn)血小板聚集可能通過受體依賴通路激活血小板而發(fā)揮效應(yīng)?？傊?，SV-LAAO可能通過以上一種或幾種作用機(jī)制誘導(dǎo)血小板的聚集，其具體作用機(jī)制需深入研究。

從認(rèn)知難度上看，分?jǐn)?shù)和小數(shù)形式的數(shù)的理解要遠(yuǎn)比整數(shù)困難．因此，RJ版教科書有理數(shù)章節(jié)的例題可以根據(jù)知識(shí)理解的難易程度來適當(dāng)調(diào)整各形式例題的比重，改變目前以整數(shù)為主的例題形式，適當(dāng)增加分?jǐn)?shù)和小數(shù)形式考查有理數(shù)的例題比重，幫助學(xué)生更好地理解難點(diǎn)．

3.1.2 SV-LAAO對(duì)血小板聚集的抑制作用

來自 Echis colorata，Naja naja kaouthia［10］，Agkistrodon halys blomhoffi［12］，Naja naja oxiana［18］，Vipera berus berus［20］，Agkistrodon blomhoffii ussurensis［29］，Agkistrodon halys Pallas［32］，Vipera lebetina［37］和Daboia russellii siamensis蛇毒的 LAAOs能抑制ADP、膠原和TMVA等誘導(dǎo)的血小板聚集。Daboia russellii siamensis LAAO(DRS-LAAO)抑制由 ADP和TMVA誘導(dǎo)的血小板聚集呈劑量相關(guān)性。Agkistrodon halys blomhoffii M-LAAO，呈劑量依賴性地抑制高切力和低切力誘導(dǎo)的血小板聚集;并且L-Leu大量存在時(shí)，該LAAO能顯著提高其抑制低切力引起的血小板聚集作用，而對(duì)高切力引起的血小板聚集無明顯作用;而當(dāng)catalase存在時(shí)，其抑制作用被清除［12］。這說明H2O2在SV-LAAO抑制血小板聚集中可能起重要作用，該作用并受血小板聚集程度和強(qiáng)度的影響［12］。Sakurai等人得到了相同的結(jié)果:眼鏡蛇毒K-LAAO抑制低切力誘導(dǎo)的血小板聚集作用明顯強(qiáng)于高切力誘導(dǎo)的聚集，其作用和單純由H2O2作為血小板抑制劑作用相似［10］。Tonismagi等人也發(fā)現(xiàn)Vipera lebetina蛇毒LAAO抑制由ADP、collagen誘導(dǎo)的血小板聚集明確與其催化產(chǎn)生的H2O2密切相關(guān)［37］。本課題組得到的 Akbu-LAAO，在其濃度為66.7 μg/mL時(shí)對(duì)ADP誘導(dǎo)的兔和人血小板聚集的抑制率為73.6%和30.3%，但不同的是，其抑制效應(yīng)無明顯劑量相關(guān)性，說明不同蛇毒LAAO作用的差異性;另外，Akbu-LAAO對(duì)人和兔血小板聚集抑制作用有顯著差別，以動(dòng)物血小板代替人血小板進(jìn)行類似實(shí)驗(yàn)，有一定風(fēng)險(xiǎn)，所得數(shù)據(jù)可能有失偏頗［29］。

3.1.3 SV-LAAO對(duì)血小板作用機(jī)制探討

目前，為什么有些SV-LAAOs抑制血小板聚集，有些SV-LAAOs卻誘導(dǎo)血小板聚集尚不十分清楚。但可肯定的是其作用在很大程度上與SV-LAAO氧化產(chǎn)生的H2O2相關(guān)，因?yàn)槿コ鼿2O2可以降低或消除該效應(yīng)［7］。LAAOs抑制血小板聚集可能是因?yàn)镠2O2干擾了GPIIb/IIIa和血纖維蛋白原間的相互激活［1，6］。LAAOs 誘導(dǎo)血小板聚集可 能是 因?yàn)镠2O2促進(jìn)了血栓烷的合成［38］，進(jìn)而引發(fā)血小板聚集。

SV-LAAO氧化產(chǎn)生的H2O2不是影響血小板作用唯一因素，其也可能通過與血小板表面受體、通過受體依賴通路激活血小板而發(fā)揮效應(yīng)，SV-LAAO也可能通過未知作用機(jī)制影響血小板功能。SV-LAAO對(duì)血小板確切作用機(jī)制研究，將有助于闡明血小板聚集機(jī)理，為SV-LAAO在心血管疾病治療的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3.2 SV-LAAO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是由基因控制自發(fā)的程序性細(xì)胞死亡過程，對(duì)正常組織的發(fā)生發(fā)展和機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起重要作用。血管新生是腫瘤得以持續(xù)生長(zhǎng)的必要條件，而血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化是血管生成的中心環(huán)節(jié)。許多SV-LAAOs具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，能夠通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制血管生成，因此SV-LAAO被應(yīng)用于腫瘤研究和腫瘤治療，成為研究熱點(diǎn)［39-45］。

Araki等首次報(bào)道出血性蛇毒可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，但沒有指出其活性組分。不久，Suhr和Torii證實(shí)LAAO是蛇毒誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要因子。隨后，陸續(xù)有研究者報(bào)道SV-LAAO可導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞/鼠內(nèi)皮細(xì)胞KN-3的染色質(zhì)發(fā)生凝聚、斷裂、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞、人骨髓性白血病細(xì)胞、小鼠淋巴細(xì)胞、人單核細(xì)胞MM6、人肺癌上皮細(xì)胞A549、人類T細(xì)胞MOLT-4、HL-60細(xì)胞和K562 細(xì)胞凋亡［20，23，32］。

一般研究認(rèn)為:由SV-LAAO催化產(chǎn)生的H2O2在其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起重要作用。catalase的加入、H2O2濃度降低或去除后，多種蛇毒LAAOs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能均降低或消除［17，20，46］;產(chǎn)生的 H2O2在低濃度時(shí)，表現(xiàn)為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，在高濃度時(shí)引起細(xì)胞壞死。SV-LAAO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方式巧妙，首先結(jié)合在細(xì)胞表面，在局部區(qū)域產(chǎn)生較高濃度的H2O2，通過誘導(dǎo)靶細(xì)胞氧化壓力引起細(xì)胞凋亡。這一細(xì)胞凋亡機(jī)制經(jīng)過熒光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)確證，并具有一定膜依賴性，因?yàn)槟た寡趸瘎?trolox可抑制 SVLAAO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而水溶性抗氧化劑lascorbate卻不能抑制其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［23］。但SV-LAAO和外源性H2O2誘導(dǎo)凋亡作用機(jī)制明顯不同:1)用兩者處理細(xì)胞后，細(xì)胞表現(xiàn)出的形態(tài)變化不同;2)抗氧化劑或自由基清除劑能阻止LAAO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但不能阻止外源性H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。很明顯，SV-LAAO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不單獨(dú)依賴反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2。Agkistrodon acutus蛇毒LAAO通過產(chǎn)生的活性氧、激活凋亡蛋白酶-3、-8，而誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡［21］，Alves 等［22］也發(fā)現(xiàn) Bothrops atrox 蛇毒 LAAO通過激活凋亡蛋白酶-3、-8誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，因此SV-LAAO也可能通過死亡受體途徑、線粒體途徑及H2O2途徑共同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

SV-LAAO抗腫瘤作用研究尚在起步，其可能通過在氧化反應(yīng)過程中產(chǎn)生的H2O2而激發(fā)活性氧損害內(nèi)皮細(xì)胞、或通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、或通過影響凋亡相關(guān)基因/蛋白水平或抑制血小板聚集途徑達(dá)到抗腫瘤作用［28，46-48］。但毋庸置疑，SV-LAAO誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用明顯，且作用機(jī)制獨(dú)特，其成為潛在新型抗腫瘤藥物研發(fā)價(jià)值巨大。

3.3 SV-LAAO細(xì)胞毒作用

SV-LAAOs具有明顯的細(xì)胞毒性作用:1)Bothrops pauloensi蛇毒 LAAO 對(duì) SKBR-3、Jurkat和 EAT細(xì)胞株產(chǎn)生劑量依賴型細(xì)胞毒作用［1］;2)Korean LAAO對(duì)L1210、人 T細(xì)胞白血病細(xì)胞MOLT-4、人造血干細(xì)胞RP-MI1788、人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60、鼠脾細(xì)胞及卵巢癌細(xì)胞Hela等細(xì)胞系都有毒性作用，只是不同種屬細(xì)胞對(duì)其敏感性不同;3)眼鏡王蛇毒LAAO對(duì)胃癌CRL5971和黑色素瘤B16細(xì)胞呈現(xiàn)明顯毒性，并抑制細(xì)胞的黏附及增殖能力;4)竹葉青蛇毒LAAO對(duì)人T細(xì)胞白血病C8166細(xì)胞有明顯毒性作用，并呈劑量相關(guān)性［13］;5)廣西眼鏡王蛇毒LAAO則對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞系CNE-2、人舌癌細(xì)胞系TCA-8113、人肝癌細(xì)胞系Bel-7404及人腭部小涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞系NACC有毒性作用［39］;6)BF-LAAO對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞也具有一定的細(xì)胞毒性。SV-LAAOs的細(xì)胞毒性作用與其催化產(chǎn)生的H2O2相關(guān)，catalase的加入可抑制其對(duì)細(xì)胞的毒性［28］;SV-LAAOs的細(xì)胞毒性作用也可能與其在細(xì)胞表面局部產(chǎn)生H2O2，進(jìn)而干擾了細(xì)胞代謝活動(dòng)有關(guān)［1，25］。

3.4 SV-LAAO 抗菌活性

微生物易對(duì)抑菌劑產(chǎn)生抗性，使由細(xì)菌感染引起的疾病治療變得困難。SV-LAAO是有效抗菌消炎物質(zhì)，并對(duì)微生物治療不產(chǎn)生抗藥性，可潛在替代市場(chǎng)上的ceftazidine(頭孢他啶)和chloramhenicol(氯霉素)類藥物［11，29，49］。

Bothrops pauloensis［1］，Bothrops jararaca［8］，Trimeresurus jerdoni I［11］，Trimeresurus mucrosquamatus［13］，Naja naja oxiana［18］，Crotalus durissus cascavella［25］，Bothrops moojeni［26］，Agkistrodon halys Pallas［32］，Vipera lebetina［37］，Bothrops marajoensis［50］和Bothrops atrox［51］蛇毒 LAAOs 具有抑菌活性，但抑菌選擇性差異較大。Pseudechis australis蛇毒LAAO，DRS-LAAO，Trimeresurus mucrosquamatus LAAO 和Casca LAAO［25］均可抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng);江浙蝮蛇毒LAAO對(duì)4個(gè)真菌亞門的真菌和大腸桿菌的生長(zhǎng)抑制作用明顯［32］。我們采用平板紙片瓊脂法發(fā)現(xiàn)Akbu-LAAO特異性抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，劑量效應(yīng)明顯，而對(duì)大腸桿菌、綠膿桿菌、白色念珠菌等無抑菌效果;定量分析表明，Akbu-LAAO的抑菌效果是相同條件下頭孢類藥物劑效的18 倍［29］。

SV-LAAO的抗菌活性與其催化產(chǎn)生的H2O2相關(guān)，其抗菌活性可被catalase消除。盡管SV-LAAO氧化反應(yīng)釋放的H2O2達(dá)不到抑制細(xì)菌生長(zhǎng)所需濃度，但由于其結(jié)合在細(xì)菌表面，從而在細(xì)菌表面局部產(chǎn)生較高濃度的H2O2直接作用于細(xì)菌，因此少量SV-LAAOs就能明顯抑制細(xì)菌生長(zhǎng)［52，53］。SV-LAAO抗菌作用的選擇性，與不同SV-LAAO對(duì)不同細(xì)菌有不同的結(jié)合能力相關(guān)，即與不同SV-LAAO可能具有的特殊分子結(jié)構(gòu)或不同微生物個(gè)體具有不同細(xì)胞外圍結(jié)構(gòu)導(dǎo)致二者結(jié)合差異相關(guān)。微生物對(duì)活性氧敏感性比人正常組織要高好多倍，加之SV-LAAO對(duì)增生的病原微生物毒性很強(qiáng)，而對(duì)宿主細(xì)胞和正常的微生物菌群毒性很?。?4］，因此可利用SV-LAAO選擇毒性靶向治療疾病。有的SV-LAAO與細(xì)菌細(xì)胞膜表面的結(jié)合在其抗菌活性過程中似乎起不到重要作用，其催化產(chǎn)生的H2O2可誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞膜破裂，致使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物流出，以致細(xì)菌死亡［25］。另外，SV-LAAO糖鏈對(duì)其抗菌活性也有一定促進(jìn)作用。因此，不同的SV-LAAO的抑菌可能通過以上作用機(jī)制中的一種或幾種作用的協(xié)同。盡管SV-LAAO抑菌詳細(xì)機(jī)理尚不清楚，但可肯定的是其催化產(chǎn)生的H2O2對(duì)其抑菌起重要作用:H2O2可誘導(dǎo)靶細(xì)胞的氧化壓力，使細(xì)胞膜破裂、內(nèi)容物流出、導(dǎo)致細(xì)菌死亡，從而發(fā)揮抑菌作用。

3.5 SV-LAAO其它生物學(xué)活性

除以上研究較多的生物活性外，SV-LAAO還具有刺激水腫形成、誘導(dǎo)出血或溶血、抗病毒、抗寄生蟲和抗HIV活性等生理作用。

3.5.1 SV-LAAO 與水腫

給老鼠注射Eristocophis macmahoni蛇毒LAAO可刺激水腫形成［17］。Wei等報(bào)道SV-LAAO可通過損害內(nèi)皮細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞，使血管通透性迅速增加，誘導(dǎo)肺出血和肺水腫;被毒蛇咬傷后，傷者病理學(xué)改變主要是紅細(xì)胞和白細(xì)胞增高，局部迅速紅腫、呼吸困難，這種現(xiàn)象可能就與LAAO引起肺部損傷有關(guān)［28］。事實(shí)上，SV-LAAO也參與蛇傷后引起的炎癥過程，可刺激淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子 IL-6，IL-2 和 IL-12［42］。

3.5.2 SV-LAAO 誘導(dǎo)出血或溶血

Agkistrodon contortrix laticinctus蛇毒LAAO可誘導(dǎo)老鼠出血，最小劑量為10 μg。Eristocophis macmahoni和Bothrops jararaca LAAOs對(duì)鼠和羊呈現(xiàn)一定溶血活性;隨著catalase的加入，LAAO的溶血活性消失，說明SV-LAAO催化產(chǎn)生的H2O2在其誘導(dǎo)的溶血過程中起重要作用［8，17］。

3.5.3 SV-LAAO 抗 HIV/病毒活性

Trimeresurus stejnegeri［15］，Bothrops moojeni［24］和Calloselasma rhodostoma LAAOs［26］都具有抗 HIV 活性;Trimeresurus stejnegeri LAAO可劑量依賴地抑制HIV病毒的感染和復(fù)制，catalase的加入可使其活性降低15倍［15］。而相同條件下，外源H2O2不具有抗HIV活性，這說明SV-LAAO的這種抗病毒活性與H2O2的產(chǎn)生相關(guān)，但不是唯一作用機(jī)制。

3.5.4 SV-LAAO 抗寄生蟲活性

SV-LAAOs還具有抗寄生蟲活性，Bothrops pirajai［6］，Bothrops moojeni［24］，Bothrops jararaca，Bothrops pauloensis［25］和 Crotalus durissus cascavella［32］蛇 毒LAAOs都具有抗利什曼原蟲的活性，它們通過抑制利什曼原蟲的鞭毛運(yùn)動(dòng)來顯示療效。SV-LAAO抗利什曼原蟲活性需要培養(yǎng)基中氨基酸存在，catalase可消除這種效應(yīng)，說明H2O2在SV-LAAO該活性發(fā)揮中起重要作用，且需相對(duì)較高濃度的H2O2來殺死利什曼原蟲細(xì)胞［50，51］?；谶@些發(fā)現(xiàn)，我們不難預(yù)測(cè)如果將SV-LAAO開發(fā)為治療利什曼原蟲或其它寄生蟲引起疾病的有效藥物，將具有很高的臨床應(yīng)用前景。

4 展望

本文主要綜述了近10年來在SV-LAAO的酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特性、生物學(xué)功能及其作用機(jī)制方面的研究進(jìn)展。重點(diǎn)闡述了SV-LAAO在調(diào)控血小板聚集、刺激水腫形成、誘導(dǎo)出血或溶血、抗病毒、抗菌消炎、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抗病毒/HIV活性以及抗寄生蟲活性等領(lǐng)域的研究進(jìn)展，并對(duì)其相應(yīng)作用機(jī)制進(jìn)行了深入的總結(jié)和探討。

作為一類其生物學(xué)活性得到重新挖掘和備受青睞的物質(zhì)，SV-LAAO由于其有效的生物學(xué)活性和獨(dú)特且“神秘”的作用機(jī)制，有望開發(fā)成為新型治療心腦血管疾病、抑菌消炎、抗腫瘤、抗寄生蟲和抗病毒/HIV藥物，并且其藥效更強(qiáng)、毒性更低、副反應(yīng)更小。SV-LAAO在基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用研究領(lǐng)域的重要意義值得深入研究和探索。

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