劉艷芳，薛俊杰，2，張勁松，楊 焱，周 帥，馮娜，汪雯翰，吳 迪，張 忠，唐慶九*

1國(guó)家食用菌工程技術(shù)研究中心上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403;2南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095

蛹蟲草又名北蟲草、北冬蟲夏草，屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)，麥角菌科(Clavicipitaceae)，蟲草屬(Cordyceps)的模式種，學(xué)名為Cordyceps militaris，是一種常見的食藥用真菌［1，2］，2008 年被國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品后備受關(guān)注。甘露醇是其活性成分之一，具有利尿脫水、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等多種功效［3］。甘露醇含量的高低已成為蟲草產(chǎn)品的質(zhì)控指標(biāo)之一。

目前用于甘露醇測(cè)定的方法主要有化學(xué)比色法［4］、氣相色譜法［5］、高效液相色譜法［6-7］等，化學(xué)比色法易受干擾，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確;氣相色譜法需要衍生化，處理復(fù)雜。HPLC是目前理想的快速、準(zhǔn)確測(cè)定甘露醇的方法。但用于測(cè)定甘露醇的HPLC分析柱多為氨基柱，由于氨基柱存在氨基基團(tuán)從硅膠表面緩慢地漂移等問題，使用壽命有限，因此本研究使用一種配位體型分析柱，開發(fā)了分析測(cè)定甘露醇的新方法，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，為蛹蟲草中甘露醇的定量分析提供了保證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料來源

蛹蟲草子實(shí)體，購(gòu)自上海百信生物科技有限公司。

1.1.2 試劑

甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自sigma公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器

Waters600型高效液相色譜儀，Waters2414示差折光檢測(cè)器;Dionex ICS2500離子色譜分析儀;ELGA超純水制備儀。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的優(yōu)化

選用Shodex公司SUGAR SP0810柱(300 mm×8 mm)為分析柱，以超純水為流動(dòng)相洗脫，示差折光檢測(cè)器檢測(cè)，對(duì)流速及柱溫等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定色譜分析條件。

1.2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

根據(jù)分析柱的特性，對(duì)提取溶劑、提取方式、提取時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定樣品前處理方法。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取烘至恒重的甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品500 mg，置于10 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度作儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液稀釋至不同濃度，進(jìn)樣分析甘露醇，根據(jù)峰面積和甘露醇含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 蛹蟲草子實(shí)體中甘露醇含量的計(jì)算

根據(jù)樣品對(duì)應(yīng)甘露醇的峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中甘露醇含量。

1.2.5 不同方法測(cè)定蛹蟲草子實(shí)體中甘露醇含量的比較

取同一批樣品，分別用化學(xué)比色法［4］、離子色譜分析法［8］及本方法測(cè)定其甘露醇含量，比較測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜分析條件

根據(jù)SUGAR SP0810分析柱的性能，選用超純水為流動(dòng)相洗脫，對(duì)分離溫度及流速進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)柱溫為70～80℃時(shí)樣品中甘露醇峰形及分離度較好;另外，隨著洗脫流速的增加，甘露醇保留時(shí)間提前，分析時(shí)間縮短，因此在保證分離度的前提下選定1.0 mL/min的流速洗脫。標(biāo)準(zhǔn)品圖譜及樣品分析圖譜如圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard and sample

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的比較

精密稱取蛹蟲草子實(shí)體粉1 g，分別加入80%乙醇、90%乙醇和無水乙醇各100 mL熱回流提取1 h，過濾去除菌粉沉淀，上清旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇后加水至50 mL混勻，樣品液經(jīng)0.45 μm膜過濾后進(jìn)行HPLC測(cè)定，分析提取量，每個(gè)處理重復(fù)3次(下同)。由表1結(jié)果可以看出，隨著乙醇濃度的增加，對(duì)甘露醇的提取率降低，無水乙醇對(duì)甘露醇的溶出效果較差，80%乙醇與90%乙醇做為提取劑對(duì)甘露醇的提取量沒有顯著差異(P＜0.05)，根據(jù)分析柱特性，為了盡量減少溶液中蛋白質(zhì)對(duì)柱子的影響，選擇以90%乙醇做為提取溶劑進(jìn)行提取。

表1 提取溶劑對(duì)蛹蟲草子實(shí)體甘露醇提取量的影響(n=3)Table 1 Contents of mannitol extracted from fruiting bodies of Cordyceps militaris with different extraction solvents(n=3)

2.2.2 提取溶劑體積的篩選

精密稱取蛹蟲草子實(shí)體粉1 g，分別加入90%乙醇50、100、150和200 mL熱回流提取1 h，按上述2.2.1處理方法處理后分析甘露醇提取量。由表2結(jié)果可知，提取溶劑增加到150 mL時(shí)，提取所得甘露醇含量最高，增加到200 mL時(shí)，甘露醇含量沒有顯著變化，因此選擇在1 g子實(shí)體中加入150 mL的90%乙醇提取。

表2 提取溶劑體積對(duì)甘露醇提取量的影響(n=3)Table 2 Contents of mannitol extracted with different volume of extraction solvents(n=3)

2.2.3 提取方式的優(yōu)化

精密稱取蛹蟲草子實(shí)體粉1 g，加入90%乙醇150 mL后分別進(jìn)行熱回流提取和超聲波提取1 h，按2.2.1處理方法處理后分析甘露醇提取量。表3結(jié)果顯示，不同提取方式對(duì)甘露醇的提取效果差異較大，熱回流方式對(duì)甘露醇的提取較為充分，提取率明顯優(yōu)于超聲波提取，因此選用熱回流方式進(jìn)行樣品前處理。

表3 提取方式對(duì)甘露醇提取量的影響(n=3)Table 3 Effects of extracting modes on the contents of mannitol(n=3)

2.2.4 提取時(shí)間的優(yōu)化

精密稱取蛹蟲草子實(shí)體粉1 g，加入90%乙醇150 mL 后分別熱回流提取 0.5、1、1.5 和 3h，按2.2.1處理方法處理后分析甘露醇提取量。表4結(jié)果顯示，熱回流提取超過1 h后，不同提取時(shí)間所得甘露醇含量無顯著性差異，因此選擇熱回流提取1 h進(jìn)行處理。

表4 提取時(shí)間對(duì)甘露醇提取量的影響(n=3)Table 4 Effects of extraction time on contents of mannitol(n=3)

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密吸取甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液適量，用超純水稀釋成一系列濃度，測(cè)定對(duì)應(yīng)濃度下甘露醇的峰面積，以甘露醇濃度(X，mg/mL)對(duì)色譜峰面積(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，y=103860x+2183.9，r=0.9999，線性范圍為 0.04 ～9.9 mg/mL。

2.3.2 精密度

取一份樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算精密度。結(jié)果表明，甘露醇含量的 R.S.D.值為0.54%，精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性

取同一批樣品，按優(yōu)化后的方法平行制備供試液5份進(jìn)行測(cè)定，考察重復(fù)性。結(jié)果表明，甘露醇含量的 R.S.D.值為3.76%，重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性

取一份樣品液分別在 0、5、10、15、20 h進(jìn)樣測(cè)定，考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果表明，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)定所得甘露醇含量的R.S.D.值為2.71%，因此，樣品在20 h內(nèi)都較為穩(wěn)定。

2.3.5 標(biāo)樣回收率的測(cè)定

分別按照樣品所含甘露醇量的50%、100%、150%加入甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行提取，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取樣測(cè)定甘露醇含量并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品回收率。試驗(yàn)結(jié)果(見表5)表明，標(biāo)樣回收率在103.11% ～107.42%之間，平均回收率為 104.27%，R.S.D.值為2.19%，說明該方法對(duì)甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)特異性良好。

表5 標(biāo)樣回收率的測(cè)定Table 5 Determination on recoveries of mannitol from samples

50.45 20 71.06 103.05 50.45 20 71.82 106.85 50.45 40 91.82 103.43 50.45 40 91.85 103.50 50.45 40 90.30 99.63 50.45 60 114.76 107.18 50.45 60 113.91 105.77 50.45 60 113.31 104.77

2.4 不同方法測(cè)得蛹蟲草子實(shí)體甘露醇含量的比較

取同一份子實(shí)體材料，分別采用本方法、離子色譜分析法及文獻(xiàn)常用的化學(xué)比色法對(duì)其甘露醇含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，化學(xué)比色法測(cè)得的甘露醇含量達(dá)8.97%，高效液相色譜法和離子色譜分析法所測(cè)結(jié)果相近，沒有顯著性差異。

表6 不同方法測(cè)得蛹蟲草子實(shí)體甘露醇含量的比較(n=3)Table 6 Comparison of mannitol contents in fruiting bodies of Cordyceps militaris determined by different methods(n=3)

3 討論

本研究選用Shodex公司SUGAR SP0810柱對(duì)蛹蟲草子實(shí)體中甘露醇進(jìn)行定量分析，對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，為避免提取物中含有大量蛋白，對(duì)分析柱造成損傷，在保證提取效果的前提下選用90%乙醇做為提取溶劑減少蛋白質(zhì)的影響。與氨基柱相比，本研究所用流動(dòng)相僅為超純水，且分析柱壽命長(zhǎng)，對(duì)甘露醇分離效果好，是一種分析甘露醇的較好的方法。

三種不同方法測(cè)定蛹蟲草子實(shí)體中甘露醇含量的結(jié)果表明，化學(xué)比色法所測(cè)含量明顯偏高，可能有雜質(zhì)干擾，因此化學(xué)比色法僅適用于測(cè)定具有一定純度的甘露醇制品，不太適用于蛹蟲草子實(shí)體中甘露醇含量的測(cè)定。而高效液相色譜法和離子色譜法都能對(duì)蛹蟲草中甘露醇的含量進(jìn)行較為準(zhǔn)確的分析，相比較而言，離子色譜儀普及度不高，試劑成本較高，所以高效液相色譜法更適于在多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。本方法的建立為蟲草產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了較好的依據(jù)。

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