楊紅 李婕 郭嘉 張尚福

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，患者的5年和10年生存率分別為14%和8%[1]。近年來(lái)肺癌的診斷和治療技術(shù)取得了一定進(jìn)步，但肺癌患者的生存率并未明顯提高。肺癌常在早中期發(fā)生鄰近組織、器官的浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，是其治療失敗的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-3（tissue inhibitor of metalloproteinases-3,TIMP-3）在抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮作用，且與突變型p53（mutant-type p53, mtp53）存在一定的相關(guān)性。本研究利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)TIMP-3和mtp53在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)情況，探討它們與NSCLC的轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類型、病理分級(jí)、TNM分期和預(yù)后等方面的關(guān)系以及二者之間的相關(guān)性，為臨床預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的治療措施提供可能的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院1998年1月-2001年12月接受根治性手術(shù)治療且保存有完整臨床資料和石蠟組織塊的NSCLC病例，按照2003年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)其組織學(xué)類型、病理分級(jí)、有/無(wú)轉(zhuǎn)移進(jìn)行評(píng)判。共篩選出原發(fā)性NSCLC 288例，男性223例，女性65例，平均年齡59.5歲（29歲-82歲）；鱗狀細(xì)胞癌（以下簡(jiǎn)稱為鱗癌）125例，腺癌129例，腺鱗癌34例；高分化癌27例，中分化癌112例，低分化癌115例（34例腺鱗癌無(wú)法進(jìn)行分級(jí)）；伴有轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶肺癌組織150例，實(shí)際收集其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織106例。根據(jù)2007年肺癌國(guó)際TNM分期修訂版標(biāo)準(zhǔn)：I期98例，II期53例，III期102例，IV期35例。選取同期手術(shù)的24例良性病變（包括肺結(jié)核、囊腫、炎性假瘤及錯(cuò)構(gòu)瘤）肺支氣管粘膜上皮組織作為對(duì)照?；颊咝g(shù)前均未行放療或化療，并行術(shù)后隨訪，截止日期為2006年8月31日，中位生存時(shí)間29個(gè)月。生存期的計(jì)算從診斷日期起至隨訪日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 組織芯片的制作 本實(shí)驗(yàn)采用手工制作組織芯片。首先選擇所需病例的存檔蠟塊，根據(jù)HE染色切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位（避開出血、壞死、明顯炎細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維化區(qū)域）后在HE切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標(biāo)記。根據(jù)樣本的數(shù)量及所要求組織片的大小在空白石蠟塊（組織芯片專用）上鉆孔，此實(shí)驗(yàn)選用鉆頭的直徑為1.5 mm，再用金屬空心管（內(nèi)徑仍為1.5 mm）從經(jīng)定位的目標(biāo)石蠟塊上鉆取組織并轉(zhuǎn)移至已鉆孔的空白石蠟塊的相應(yīng)位置。每一個(gè)選中蠟塊（包括原發(fā)灶癌組織、轉(zhuǎn)移灶癌組織和對(duì)照組織）選3個(gè)組織芯放入芯片中（對(duì)有可能掉片的病例選4個(gè)組織芯放入芯片中）。使用病理切片機(jī)制備4 μm組織切片，置于經(jīng)防脫片處理的載玻片上，放入56oC烤箱中烘烤48 h。常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組織化學(xué)染色 TIMP-3為兔抗人多克隆抗體（購(gòu)自博士德生物技術(shù)開發(fā)有限公司），工作稀釋度為1:100，用微波枸櫞酸進(jìn)行抗原修復(fù)，以胎盤絨毛作為陽(yáng)性對(duì)照，采用LSAB法染色（SP法，試劑盒購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。mtp53抗體為鼠抗人單克隆抗體（購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），工作稀釋度為1:50，用水浴EDTA進(jìn)行抗原修復(fù)，以乳腺癌作為陽(yáng)性對(duì)照，采用Elivision法染色（試劑盒購(gòu)自Dako生物技術(shù)開發(fā)公司）。

1.4 免疫組織化學(xué)結(jié)果評(píng)定 TIMP-3以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，mtp53以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。將芯片內(nèi)所有癌細(xì)胞都納入計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，將著色強(qiáng)度高于背景的細(xì)胞定為陽(yáng)性細(xì)胞。細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色顆粒都分別根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度（未著色：0分；淡黃色：1分；棕黃色：2分；棕褐色：3分）和陽(yáng)性細(xì)胞所占的構(gòu)成比評(píng)分（全陰：0分；≤10%：1分；11%-50%：2分；51%-75%：3分；＞75%：4分）；將每例獲得的兩組分?jǐn)?shù)相乘：0-3分為（-）；4分-7分為（+）；8分-12分為（++）[2]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 13.00 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用卡方檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析、Log-rank檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)分析方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TIMP-3和mtp53在良性病變、NSCLC原發(fā)灶癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌中的表達(dá)情況 TIMP-3在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細(xì)胞中均呈陽(yáng)性表達(dá)（100%）；288例NSCLC原發(fā)灶肺癌組織中呈（-）表達(dá)42例（14.6%）、（+）表達(dá)101例（35.1%）、（++）表達(dá)145例（50.3%），其陽(yáng)性表達(dá)率為85.4%；106例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織中呈（-）表達(dá)25例（23.6%）、（+）表達(dá)38例（35.8%）、（++）表達(dá)43例（40.6%），其陽(yáng)性表達(dá)率為76.4%。原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織TIMP-3的表達(dá)明顯低于正常支氣管黏膜上皮組織（P＜0.01）。見圖1。

mtp53在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細(xì)胞中均呈陰性表達(dá)；288例NSCLC原發(fā)灶癌組織中呈（-）表達(dá)161例（55.9%）、（+）表達(dá)54例（18.8%）、（++）表達(dá)73例（25.3%），其陽(yáng)性表達(dá)率為44.1%；在106例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織中呈（-）表達(dá)53例（50.0%）、（+）表達(dá)27例（25.5%）、（++）表達(dá)26例（24.5%），其陽(yáng)性表達(dá)率為50.0%。原發(fā)灶與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶癌組織mtp53的表達(dá)明顯高于正常支氣管粘膜上皮組織（P＜0.01）。見圖2。

2.2 TIMP-3和mtp53的表達(dá)與轉(zhuǎn)移的關(guān)系 不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的138例原發(fā)灶癌組織中TIMP-3呈（-）表達(dá)14例（10.1%）、（+）表達(dá)43例（31.2%）、（++）表達(dá)81例（58.7%），而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的150例原發(fā)灶癌組織中TIMP-3呈（-）表達(dá)28例（18.6%）、（+）表達(dá)58例（38.7%）、（++）表達(dá)64例（42.7%），兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）。不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的138例原發(fā)灶癌組織中mtp53呈（-）表達(dá)88例（63.8.1%）、（+）表達(dá)23例（16.7%）、（++）表達(dá)27例（19.5%），而伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的150例原發(fā)灶癌組織中mtp53呈（-）表達(dá)73例（48.6%）、（+）表達(dá)31例（20.7%）、（++）表達(dá)46例（30.7%），兩組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030）。

2.3 TIMP-3和mtp53的表達(dá)與病理學(xué)分級(jí)、組織學(xué)類型及TNM分期之間的關(guān)系 見表1。TIMP-3的表達(dá)與NSCLC的病理學(xué)分級(jí)有關(guān)，在高分化癌細(xì)胞中的表達(dá)高于中分化和低分化癌細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.030）；TIMP-3的表達(dá)與NSCLC的組織學(xué)類型和TNM分期無(wú)關(guān)（P＞0.05）。mtp53的表達(dá)與NSCLC的組織學(xué)類型和TNM分期有關(guān)（P=0.004, P=0.016），其在腺癌中的表達(dá)最低，在腺鱗癌中的表達(dá)最高，隨TNM分期的增加而增加，與NSCLC的病理學(xué)分級(jí)無(wú)關(guān)（P=0.347）。

2.4 TIMP-3和mtp53表達(dá)的相關(guān)分析 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示TIMP-3與mtp53在NSCLC癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.156, P=0.008）。

2.5 TIMP-3和mtp53的表達(dá)與患者生存的關(guān)系 分析TIMP-3和mtp53在NSCLC病灶中的表達(dá)與患者的術(shù)后生存率有關(guān)：TIMP-3在病灶中呈（++）表達(dá)的NSCLC患者生存率最高，呈（-）表達(dá)者生存率最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.055, P=0.011）；mtp53呈（-）表達(dá)的NSCLC患者生存率最高，呈（++）表達(dá)者生存率最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.829, P=0.003）（圖3）。

3 討論

TIMPs能特異性的抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）的活性，阻止細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。大量研究顯示TIMP-3的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后有很大的相關(guān)性，Powe等[3]研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸低分化腺癌的浸潤(rùn)邊緣TIMP-3的表達(dá)明顯降低，提示邊緣TIMP-3表達(dá)的降低與腫瘤浸潤(rùn)有很大的關(guān)系；TIMP-3的表達(dá)降低是食管癌的浸潤(rùn)增強(qiáng)、分期增加和預(yù)后較差的主要原因[4,5]；Span等[6]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中，TIMP-3高表達(dá)的患者比低表達(dá)者預(yù)后好，Celebiler等[7]的研究結(jié)果也顯示TIMP-3的低表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌轉(zhuǎn)移；Mino等[8]研究TIMP-3在肺癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，TIMP-3的弱、中、強(qiáng)表達(dá)率差異在鱗癌中表現(xiàn)更為明顯，TIMP-3的低表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，TIMP-3與患者的生存預(yù)后相關(guān)。這些研究結(jié)果都表明TIMP-3表達(dá)的降低會(huì)導(dǎo)致腫瘤更具有浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的能力，而Riddick等[9]在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)TIMP-3的表達(dá)與預(yù)后沒有明顯的相關(guān)性，而高表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移相關(guān)，但是在局部還是有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用；Kornfeld等[10]的研究結(jié)果顯示在頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌中TIMP-3 mRNA高表達(dá)者預(yù)后較低表達(dá)者更差?？傊?，TIMP-3在不同腫瘤中的作用機(jī)制還不是很一致，還需要大量的研究證明。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TIMP-3在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細(xì)胞中均呈100%表達(dá)，而在288例NSCLC原發(fā)灶癌組織中陽(yáng)性表達(dá)已降為85.4%；且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶癌組織中TIMP-3表達(dá)明顯低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶。因此我們推測(cè)TIMP-3的低表達(dá)與NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與Mino等[8]的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果中TIMP-3的表達(dá)與NSCLC的TNM分期無(wú)關(guān)，推測(cè)主要受腫瘤大小影響。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)TIMP-3的表達(dá)與NSCLC的分化程度有關(guān)，NSCLC分化越好，TIMP-3的表達(dá)率越高；但TIMP-3的表達(dá)與NSCLC的組織學(xué)類型無(wú)關(guān)，這與Mino等[8]研究結(jié)果不一致，可能由于人種和地域的差異，這方面需要更進(jìn)一步的研究和分析。

表1 TIMP-3和mtp53在不同非小細(xì)胞肺癌病變組織中表達(dá)差異的分析Tab 1 Analysis of expression difference of TIMP-3 and mtp53 in distinct non-small cell lung cancer (NSCLC) pathological tissues

圖1 TIMP-3在肺良性病變支氣管粘膜上皮組織（A）、鱗狀細(xì)胞癌（B）、腺癌（C）與腺鱗癌（D）中的表達(dá)（LSAB，×400 ）Fig 1 The expression of TIMP-3 in benign lesion's bronchus mucosa epithelium (A), squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and adenosquamous carcinoma (D) (LSAB, ×400)

圖2 mtp53在肺良性病變支氣管黏膜上皮組織（A）、鱗狀細(xì)胞癌（B）、腺癌（C）與腺鱗癌（D）中的表達(dá)（Elivision，×400）Fig 2 The expression of mtp53 in benign lesion's bronchus mucosa epithelium (A), squamous cell carcinoma (B), adenocarcinoma (C) and adenosquamous carcinoma (D) (Elivision, ×400)

圖3 TIMP-3（A）與mtp53（B）在NSCLC患者中不同表達(dá)情況的Kaplan-Meier生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival curves of NSCLC patients with expression of TIMP-3 (A) and mtp53 (B)

肺癌患者p53基因突變率居人類腫瘤的首位，其基因功能的失活在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，60%的NSCLC和80%的小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer,SCLC）可檢測(cè)到p53基因的突變[11]。張霞等[12]研究表明mtp53蛋白在肺癌中表達(dá)率為51.8%，其表達(dá)率與腫瘤的分化程度有關(guān)，分化越差，表達(dá)率越高。李愛武等[13]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC癌組織的mtp53蛋白表達(dá)（60%）較正常肺組織（5%）明顯增高，提示p53突變可能參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其中mtp53蛋白在肺腺癌組織中的表達(dá)分別高于腺鱗癌及鱗癌，原發(fā)腫瘤T3-T4組織中的mtp53蛋白表達(dá)較原發(fā)腫瘤T1-T2高，mtp53蛋白在低分化癌組織中的表達(dá)較中、高分化癌組織高，說(shuō)明mtp53蛋白的表達(dá)與腫瘤的病理學(xué)類型、原發(fā)腫瘤范圍及分化程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中mtp53在24例肺良性病變的支氣管粘膜上皮細(xì)胞中均不表達(dá)，而在288例NSCLC原發(fā)灶癌組織中陽(yáng)性表達(dá)為44.1%；且在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶癌組織中mtp53表達(dá)明顯高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)灶；同時(shí)mtp53的表達(dá)隨NSCLC的TNM分期增加而升高。本研究中mtp53的表達(dá)在腺癌中最低，其次為鱗癌，在腺鱗癌中表達(dá)最高，因此mtp53的表達(dá)與NSCLC組織學(xué)類型的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

關(guān)于TIMP-3和mtp53的相關(guān)性在肺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和預(yù)后中的研究甚少。Thomas[14]和Loging等[15]發(fā)現(xiàn)mtp53具有抑制TIMP-3表達(dá)的作用，從而使受TIMP-3抑制的MMPs表達(dá)增加，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞凋亡和促進(jìn)腫瘤組織內(nèi)血管形成的作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。Zalcenstein等[16]通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)mtp53可以通過(guò)抑制Fas啟動(dòng)子的活性，下調(diào)Fas mRNA的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制Fas的表達(dá)，從而進(jìn)一步抑制了TIMP-3通過(guò)Fas途徑誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果也顯示，TIMP-3與mtp53在NSCLC組織中的表達(dá)存在負(fù)相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致，但其分子機(jī)制需要進(jìn)一步的研究。

綜上，TIMP-3的低表達(dá)與mtp53的高表達(dá)都可以促進(jìn)NSCLC的轉(zhuǎn)移且二者之間存在抑制作用，可以考慮從增加TIMP-3的表達(dá)、降低mtp53的表達(dá)方面著手研究更好的腫瘤治療方法。臨床上也可將二者結(jié)合起來(lái)，有助于提高對(duì)NSCLC發(fā)生轉(zhuǎn)移可能性和預(yù)后等方面預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，或可能成為NSCLC患者預(yù)防腫瘤轉(zhuǎn)移的一種治療措施。