徐慶陽，孫家凱，謝希賢，陳 寧

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

過表達hom基因對谷氨酸棒桿菌發(fā)酵L–異亮氨酸的影響

徐慶陽，孫家凱，謝希賢，陳 寧

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中hom基因編碼的高絲氨酸脫水酶為L–異亮氨酸合成過程的關鍵酶，本研究通過在L–異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW中過表達高絲氨酸脫水酶，考察過表達高絲氨酸脫水酶對發(fā)酵L–異亮氨酸產(chǎn)量的影響．以L–異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW基因組為模板克隆hom基因，將hom基因與表達載體pXMJ19連接構建出重組質粒pXMJ19-hom，再轉入C. glutamicum YILW構建C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)．通過5,L罐發(fā)酵研究重組質粒對工程菌的生長、耗糖、L–異亮氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累等方面的影響．結果顯示，重組酶的表達使菌株對L–蘇氨酸的抗反饋抑制作用得到加強．最終L–異亮氨酸和L–蛋氨酸積累量分別為36.5,g/L和2.8,g/L，分別較出發(fā)菌株提高7%和33%，同時L–賴氨酸合成量僅為2.1,g/L，較出發(fā)菌株降低了63.8%．

L–異亮氨酸；高絲氨酸脫水酶；過表達；谷氨酸棒桿菌

Abstract：Homoserine dehydratase，a key enzyme of L-isoleucine synthesis process，is encoded by the hom gene in Corynebacterium glutamicum. The effect of overexpressed homoserine dehydratase in C. glutamicum YILW on the production of L-isoleucine was studied. The hom gene was PCR amplified using C. glutamicum YILW genom ic DNA as template and then inserted into a multicopy plasmid pXMJ19,to construct a recombined expression plasmid pXMJ19-hom. The recombined plasm id was then transformed into C. glutamicum YILW to construct recombined C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom). The effects of pXMJ19-hom on cell grow th，glucose consumption rate，yield of L-isoleucine and accumulation of byproducts were investigated by using 5,L batch fermentation. Enzyme studies showed that the recombined homoserine dehydratase expressed in C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)strain was much less sensitive to threonine inhibition. Compared w ith the original strain，the yields of L-isoleucine and L-methionine by using C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)were 36.5,g/L and 2.8,g/L，which indicated on increase of 7% and 33% respectively，but the yield of L-lysine was only 2.1,g/L，decreased by 63.8%.

Key words：L-isoleucine；homoserine dehydratase；overexpression；C. glutamicum

L–異亮氨酸(L-isoleucine)屬于分支鏈氨基酸，是人體必需的八種氨基酸之一，具有多種生理功能，廣泛應用于醫(yī)藥、食品及其調味劑、動物飼料、化妝品的制造，尤其是在醫(yī)學研究和治療中有十分重要的作用[1]．目前，利用微生物生產(chǎn)L–異亮氨酸的方法主要為直接發(fā)酵法，L–異亮氨酸產(chǎn)生菌大多由谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌及大腸桿菌選育而來[2]．工業(yè)化生產(chǎn)中廣泛應用的L–異亮氨酸高產(chǎn)菌多為經(jīng)過傳統(tǒng)誘變育種獲得的谷氨酸棒桿菌，但其副生雜酸比較多，尤其是賴氨酸、丙氨酸等，加大了后期提取獲得高純度L–異亮氨酸的難度[3]．

高絲氨酸脫水酶(homoserine dehydrogenase，EC1.1.1.3)是谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)中L–異亮氨酸的合成途徑中的關鍵酶之一，由hom基因編碼，受蘇氨酸的反饋抑制和蛋氨酸的反饋阻遏．在L–異亮氨酸生物合成過程中，天冬氨酸半醛是合成賴氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸的共同代謝中間體，在谷氨酸棒桿菌中L–蛋氨酸和L–異亮氨酸均不同程度地阻遏hom-thrB操縱子的轉錄，阻斷天冬氨酸半醛進入L–異亮氨酸生物合成途徑，從而在一定程度上促進了賴氨酸的生物合成[4]．通過過表達關鍵酶解除其反饋抑制可以提高目的產(chǎn)物的代謝流量，減少中間產(chǎn)物的積累及副產(chǎn)物形成[5]．

前期實驗中，史建明等[6]通過在C. glutamicum YILW中過量表達解除反饋抑制的蘇氨酸脫水酶使得L–異亮氨酸產(chǎn)量增加了10.3%，達到32,g/L，副產(chǎn)物L–蛋氨酸及L–賴氨酸積累均有一定程度下降；在前期實驗基礎上，本文通過在C. glutamicum YILW中過量表達解除反饋抑制的高絲氨酸脫水酶，考察其對L–異亮氨酸產(chǎn)量及副產(chǎn)物積累等方面的影響，為進一步構建L–異亮氨酸高產(chǎn)菌奠定了實驗及理論基礎．

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

谷氨酸棒桿菌C. glutamicum ATCC13032，L–異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW(α–氨基–β–羥基戊酸抗性)，大腸桿菌–谷氨酸棒桿菌穿梭質粒pXMJ19(氯霉素抗性)，均保存于天津科技大學代謝工程研究室．

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、限制性內切酶，TaKaRa公司；PCR引物，華大基因有限公司；1,kbp DNA marker，F(xiàn)ermentas公司；DNA片膠回收試劑盒、基因組DNA的提取試劑盒、質粒小樣快速提取試劑盒，北京博大泰克生物公司；氯霉素，北京索萊寶公司；蛋白胨、酵母粉，Oxoid公司；考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為國產(chǎn)分析純．

JY92–IIN型細胞超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；PTC–1148型PCR儀，美國BIO– RAD公司．

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基，見參考文獻[7]．

1.4 方法

1.4.1 pXMJ19-hom表達載體的構建

以C. glutamicum YILW染色體DNA為模板，使用P1(5′-CGGCTAGAGCTC GTTCAATTGCCATGT CAGT-3′，劃線處為Sac I酶切位點)和P2(5′-GCGCCGATCTAGA GTAATAGGACAACAACGC TC-3′，劃線處為Xba I酶切位點)為引物PCR擴增出高絲氨酸脫水酶編碼基因hom．使用Sac I和Xba I對PCR產(chǎn)物及質粒pXM J19進行雙酶切，連接產(chǎn)物化學轉化法轉入E. coli DH5α，在終濃度為25,μg/m L氯霉素的LB平板上37,℃培養(yǎng)．用引物P3(5′-GACA ATTAATCATCGGCTCG-3′)、P4(5′-CAGGCTGAAA ATCTTCTCTC-3′)鑒定長出的轉化子，挑選陽性克隆，雙酶切驗證，測序．

將測序驗證正確的重組質粒pXMJ19-hom和對照質粒pXMJ19分別電轉法轉化C. glutamicum YILW感受態(tài)細胞(C. glutamicum感受態(tài)細胞的制備與電轉化方法見文獻[8])，用含有氯霉素的LB平板進行篩選并用引物P3、P4鑒定陽性轉化子，所得陽性轉化子即為工程菌C. glutamicum YILW(pXM J19-hom)，保存菌株．

1.4.2 SDS-PAGE分析

分別挑取含有pXMJ19和pXMJ19-hom質粒的谷氨酸棒桿菌單菌落接種到含氯霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，32,℃、200,r/m in培養(yǎng)12,h后，以1%接種量轉接至新鮮LB搖瓶培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至吸光度為0.6～0.8，加IPTG(終濃度0.1,mmol/L)誘導4,h后取適量菌液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析[9]．采用5%濃縮膠及12%分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳進行蛋白分離，以C. glutamicum ATCC13032作為對照，比較C. glutamicum YILW(pXM J19)空質粒對照與C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)重組質粒蛋白表達情況．

1.4.3 酶活性分析方法

通過測定受氫體為2，3，5–氯化三苯基四唑(TTC)的脫氫酶活性來反映高絲氨酸脫水酶活性，酶活性具體測定方法及酶活力單位定義見文獻[10]．每1,m L粗酶液1,h產(chǎn)生1,μg三苯基甲膳(TF)的量作為一個酶活力單位1,U．

L–蘇氨酸對重組酶活性反饋抑制的測定：在反應體系中加入不同濃度的L–蘇氨酸，按標準酶活測定方法測定酶活．

1.4.4 其他分析方法

菌體生物量的測定方法見文獻[11]．

氨基酸含量的測定[12–13]：L–異亮氨酸、L–賴氨酸、L–蛋氨酸及L–纈氨酸含量采用高效液相分析系統(tǒng)測定，色譜分離條件：Agilent C18(15,mm× 4.6,mm，3.5,μm)，2，4–二硝基氟苯柱前衍生測定，乙腈與NaAc溶液進行梯度洗脫，柱溫33,℃，流動相流量1,m L/min，檢測波長360,nm．

2 結果與分析

2.1 構建pXM J19-hom表達質粒

以L–異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW基因組DNA為模板克隆hom基因片段，將純化后的PCR產(chǎn)物雙酶切后連接到表達載體pXMJ19上，構建出重組質粒pXMJ19-hom(圖1)．分別進行Xba I單酶切及Xba I和Sac I雙酶切驗證，結果如圖2所示．

重組質粒pXMJ19-hom單酶切后得到一條大小約為8,000,bp的特異性條帶；雙酶切后在約6,600,bp和1,400,bp處觀察到目的條帶，分別為酶切后的pXM J19載體與hom基因．結合測序結果表明重組質粒構建成功．

圖1 pXM J19-hom重組質粒的構建Fig. 1 Construction of p lasm id pXM J19-hom

圖2 重組質粒pXM J19-hom的酶切驗證Fig. 2 Restriction digest confirmation of recombined plasm id pXM J19-hom

2.2 重組質粒的誘導表達

以C. glutamicum ATCC13032為對照，比較重組菌C. glutamicum YILW(pXM J19-hom)及C. glu tamicum YILW(pXMJ19)的蛋白表達情況．超聲破碎菌體后，收集上清液，進行SDS-PAGE蛋白電泳，結果如圖3所示．

圖3 粗酶液SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of crude cell extracts

高絲氨酸脫水酶的相對分子質量為4.63×104；可以看出3種菌株在相對分子質量約為4.63×104處均有特異性條帶，但蛋白表達量有一定差異(蛋白上樣量一致)，C. glutamicum YILW(pXM J19)與 C. glutamicum ATCC13032的蛋白表達量差別不大，這可能是由于ATCC標準菌株和宿主菌中高絲氨酸脫水酶的表達量本身就比較少；但重組菌C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)蛋白表達量明顯較前兩者增多，證明表達載體pXMJ19-hom構建成功，并且高絲氨酸脫水酶得到過量表達．

2.3 L-蘇氨酸對重組酶的反饋抑制作用

將C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)和C. glutamicum ATCC13032分別培養(yǎng)至對數(shù)中期，收集細胞，超聲波破碎后，離心取上清液檢測高絲氨酸脫水酶活性．反應體系中加入不同濃度的L–蘇氨酸后，再分別加入適量的重組酶及野生型酶，按標準酶活測定方法測定酶活，結果如圖4所示．可以看出，在未添加L–蘇氨酸時，野生型酶與重組酶的活性分別為0.21,U和0.45,U，與對照菌相比，帶有質粒pXMJ19-hom的C. glutamicum YILW高絲氨酸脫水酶酶活性提高了2.1倍，此結果表明，高絲氨酸脫水酶基因能在C. glutamicum YILW中有效表達．此外，隨著L–蘇氨酸濃度的增加，酶活力均出現(xiàn)明顯下降的現(xiàn)象，尤其是野生型酶，當L–蘇氨酸濃度達到14,mmol/L時，其酶活力完全喪失，而此時重組酶仍具有一定的活性，大約為0.09,U；當L–蘇氨酸濃度進一步增加時，重組酶活力喪失速率明顯減緩，當L–蘇氨酸濃度達到16,mmol/L時，重組酶仍維持0.07,U的活性．可以看出，與標準菌相比，重組菌C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)對L–蘇氨酸的抗反饋抑制作用得到有效加強，這可能是由于C. glutamicum YILW具有α–氨基–β–羥基戊酸(AHV)抗性，AHV是蘇氨酸的結構類似物，從而在一定程度上解除了蘇氨酸對高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制，因而過表達hom基因可強化重組菌對L–蘇氨酸的抗反饋抑制作用．

圖4 L–蘇氨酸濃度對重組酶與野生型酶活力的影響Fig. 4 Effects of L-threonine concentration on the activities of recombined and native homoserine dehydratases

2.4 重組質粒對菌體生長和耗糖的影響

將C. glutamicum YILW、C. glutamicum YILW (pXM J19)和C. glutamicum YILW(pXM J19-hom)這3株菌進行5,L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵68,h，每隔4,h測定生物量及比耗糖速率等參數(shù)，結果如圖5所示．

C. glutamicum YILW菌體的延滯期最短，10,h后即進入對數(shù)生長期，且具有相對較高的比生長速率，菌體生長34,h左右進入穩(wěn)定期，至發(fā)酵結束時最大生物量可達32.5,g/L．而C. glutamicum YILW (pXM J19)菌體延滯期相對較長，且進入對數(shù)生長期后維持較低的比生長速率，菌體最大生物量為30.1,g/L，較前者低7.3%，說明空質粒pXMJ19對C. glutamicum YILW的生長有一定滯后作用，但是影響作用較??；而C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)菌體延滯期最長，并且進入對數(shù)生長期后最大比生長速率也較小，發(fā)酵結束時菌體的最大生物量僅為28.4,g/L，分別較前兩者低12.6%和5.6%．這可能是由于重組質粒pXM J19-hom復制和表達增加了菌體的代謝負擔，從而導致菌體的生物量降低．

圖5 重組質粒對菌體生物量的影響Fig. 5 Effects of recombined p lasm id on biomass

就耗糖速率而言，如圖6所示，在一定范圍內菌體生物量與耗糖速率成正比．

圖6 重組質粒對菌體耗糖速率的影響Fig. 6 Effects of recombined p lasm id on sugar consum ption rate

當菌體進入衰退期后，耗糖速率均明顯下降．C. glutamicum YILW在整個發(fā)酵過程中具有較高的耗糖速率，其最大耗糖速率為7.8,g/(L·h)，且在發(fā)酵后期仍能維持較高的耗糖速率．而重組菌C. g lutam icum Y ILW(pXM J19-hom)和C. glutamicum Y ILW(pXM J19)耗糖速率明顯較C. glutam icum Y ILW緩慢，且兩者在整個發(fā)酵過程中耗糖趨勢相似，但前者在發(fā)酵中后期耗糖速率明顯加快，在40,h左右達到最大耗糖速率8.5,g/(L·h)，這可能是由于中后期外源基因的表達使菌體能耗增加，耗糖速率快速增加，而在發(fā)酵后期耗糖速率快速下降，說明在發(fā)酵后期菌體衰退較快；此外，C. g lutam icum Y ILW (pXMJ19)最大耗糖速率僅為7.5,g/(L·h)，且在發(fā)酵后期也有一定程度的衰退．這說明外源質粒的加入對菌體的生長和耗糖均有一定的不利影響，同時重組菌容易發(fā)生衰退現(xiàn)象．

2.5 重組酶對L-異亮氨酸發(fā)酵的影響

不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)L–異亮氨酸過程中L–異亮氨酸及副產(chǎn)物積累差異情況如圖7所示．

圖7 不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)氨基酸的產(chǎn)量Fig. 7 Yield of am ino acid fermentation by different strains

由圖7可知，出發(fā)菌株C. glutamicum YILW可積累L–異亮氨酸34.1,g/L，L–賴氨酸5.8,g/L，L–蛋氨酸也有一定程度的積累．而C. glutamicum YILW (pXM J19)的3種氨基酸產(chǎn)量均有下降，其中L–異亮氨酸及L–賴氨酸產(chǎn)量分別為32.2,g/L和5.3,g/L，分別較出發(fā)菌株下降5.6%和8.6%，表明空質粒的轉入對于菌體合成氨基酸有一定的影響，這可能是由于菌體代謝負擔加重的原故．此外，重組菌C. glutamicum YILW(pXMJ19-hom)除L–賴氨酸積累有明顯下降外，其余氨基酸積累量均有明顯增加．其中L–異亮氨酸和L–蛋氨酸積累量分別為36.5,g/L和2.8,g/L，分別較出發(fā)菌株提高7%和33%，而L–賴氨酸積累量僅為2.1,g/L，較出發(fā)菌株降低了63.8%．此外，L–纈氨酸的積累量基本沒有變化．可以看出，通過在C. glutamicum YILW過表達高絲氨酸脫水酶成功強化了蘇氨酸生物合成途徑的代謝流，在一定程度上相對弱化了L–賴氨酸的生物合成，降低了L–賴氨酸積累量，使L–異亮氨酸的積累得到相對提高．

3 討 論

本研究使用的L–異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW為經(jīng)過傳統(tǒng)誘變育種獲得的谷氨酸棒桿菌，其發(fā)酵過程中積累賴氨酸比較多，從而使葡萄糖對L-異亮氨酸的轉化率降低，也不利于后期提取獲得高純度L–異亮氨酸．若進一步經(jīng)過傳統(tǒng)誘變方法選育賴氨酸缺陷型菌株會產(chǎn)生大量次級突變，造成菌體生長緩慢等弱點[14]，這是目前工業(yè)生產(chǎn)中難以解決的問題之一．隨著分子生物學和基因工程技術的興起，基因敲除、基因重組等技術的成熟，L–異亮氨酸高產(chǎn)工程菌的構建也越來越受到重視．

本研究發(fā)現(xiàn)，在L–異亮氨酸生產(chǎn)菌C. glutamicum YILW中過表達高絲氨酸脫水酶可以明顯降低副產(chǎn)物賴氨酸的積累量，但L–異亮氨酸產(chǎn)量卻沒有得到有效提高，這可能是因為L–異亮氨酸生物合成途徑較長，高絲氨酸脫水酶的過表達同時增加了分支代謝途徑的流量(L–蛋氨酸積累量提高33%)．大量研究結果表明，代謝流的控制分布在多個酶上，在任何情況下解除單個酶的反饋抑制作用是有限的[15]．Sahm等[16]通過擴增對反饋調節(jié)不敏感的高絲氨酸激酶及蘇氨酸脫水酶基因，獲得谷氨酸棒桿菌的L-異亮氨酸高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量可達30,g/L，而在本實驗中優(yōu)化過后的菌株產(chǎn)量為36.5,g/L．如果利用基因工程技術將L–異亮氨酸生物合成途徑中的其他關鍵酶基因如高絲氨酸激酶、蘇氨酸脫水酶及乙酰乳酸合成酶的基因等進行串聯(lián)表達，或者通過強化關鍵酶的啟動子以及敲除代謝支路等途徑使得碳、氮源以及能量代謝流盡可能多地進入中心代謝途徑，就可以進一步強化L–異亮氨酸合成代謝途徑．

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責任編輯：郎婧

Effects of Overexpression of Homoserine Dehydratase on L-Isoleucine Production in Corynebacterium glutamicum

XU Qingyang，SUN Jiakai，XIE Xixian，CHEN Ning
(Key Laboratory of Industrial Fermentation M icrobiology，M inistry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Q812

A

1672-6510(2012)05-0001-06

2012-03-06；

2012-04-07

國家發(fā)改委高技術產(chǎn)業(yè)化專項項目

徐慶陽（1980—），男，安徽蕭縣人，助理研究員；通信作者：陳 寧，教授，ningch@tust.edu.cn.