周露 崔敏 于達(dá)

大連婦產(chǎn)醫(yī)院，遼寧大連 116000

妊娠期高血壓疾病子癇前期是影響孕產(chǎn)婦及圍生兒發(fā)病率及死亡率的嚴(yán)重產(chǎn)科并發(fā)癥，其病因及發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前，關(guān)于其病因?qū)W方面的研究有多種理論，如內(nèi)皮細(xì)胞損傷、功能障礙、結(jié)構(gòu)損傷、滋養(yǎng)細(xì)胞過(guò)度凋亡、免疫炎癥反應(yīng)等。近年來(lái)經(jīng)過(guò)專(zhuān)家學(xué)者的研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期重度孕婦血液中的肝素水平下降為正常孕婦的50%[1]，血液呈高凝狀態(tài)，臨床采用肝素抗凝治療取得了較明顯的效果。1999年，以色列科學(xué)家Vlodavsky I等[2]從胎盤(pán)中成功克隆純化出一種名為乙酰肝素酶（heparanase，Hpa）的物質(zhì)，之后，對(duì)其研究深入開(kāi)展。那么Hpa與孕婦肝素水平下降[1]及血管內(nèi)皮損傷又有怎樣的關(guān)系呢？本實(shí)驗(yàn)就是圍繞這個(gè)問(wèn)題而開(kāi)展的。

Hpa是目前發(fā)現(xiàn)的能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）和基底膜（basement membrane，BM）主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖 （heparan sulfate proteogly can，HSPGs）和側(cè)鏈肝素（heparan sulfate，HS）及其衍生物的酶[3]，它廣泛存在于胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞、血小板、巨噬細(xì)胞、活化的T、B淋巴細(xì)胞和癌細(xì)胞等多種細(xì)胞中，通過(guò)水解其底物來(lái)參與一系列的生理和病理過(guò)程，如胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、血管形成及組織修復(fù)、炎癥、自身免疫、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等。產(chǎn)科領(lǐng)域，在胚泡植入、胎盤(pán)形成、分娩發(fā)動(dòng)及產(chǎn)科并發(fā)癥中均有較為重要的作用。Hpa在胎盤(pán)中的定位怎樣？它在正常孕婦、子癇前期輕度及子癇前期重度孕婦胎盤(pán)中的蛋白含量是否有顯著性差異？能否反映病情輕重？本實(shí)驗(yàn)用Western-blot來(lái)明確Hpa在子癇前期孕婦與正常妊娠孕婦胎盤(pán)中的定位情況及其蛋白表達(dá)水平與病情輕重的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

取遼寧大連婦產(chǎn)醫(yī)院2010年10月～2011年10月住院患者胎盤(pán)組織43例，分為3組，其中，正常對(duì)照組13例，子癇前期輕度15例，子癇前期重度15例。3組在年齡、孕周、孕產(chǎn)次、體重、身高等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。無(wú)妊娠期糖尿病、感染性疾病、肝、腎病和原發(fā)性高血壓等疾病，且未用過(guò)與此實(shí)驗(yàn)相關(guān)的藥物治療。子癇前期患者的診斷標(biāo)準(zhǔn)以第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》為依據(jù)。所取組織為臍帶根部胎盤(pán)全層1 cm3。受試者資料詳見(jiàn)表1。

表1 孕婦一般情況及胎兒情況

1.2 一般組織學(xué)處理

用于Western blot分析的新鮮組織，于術(shù)中切除后，立即于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與方法

Western-blot肝素酶一抗，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗和NBT/BCIP染色試劑盒購(gòu)自武漢博士得生物有限公司。取新鮮胎盤(pán)組織全層1 cm3，加入裂解緩沖液，剪碎，勻漿，低溫超速離心（4℃，13 000 r/min，30 min），提取上清液為細(xì)胞總蛋白，電泳（10%SDS-PAGE凝膠），轉(zhuǎn)印，5%正常小牛血清封閉，一抗（1∶500）4℃下孵育，過(guò)夜；與二抗室溫下孵育1 h，NBT/BCIP顯色30 min，水洗干燥，避光保存，測(cè)定灰度值比較結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理；乙酰肝素酶蛋白相對(duì)含量比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

3組標(biāo)本均有Hpa蛋白表達(dá)。子癇前期輕度及重度組蛋白含量明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），且子癇前期重度組與輕度組結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見(jiàn)表 2、圖 1。

表2 實(shí)驗(yàn)各組Hpa的蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

Hpa是一種能夠降解ECM和BM的主要組成成分HSPGs、側(cè)鏈乙酰肝素鹽及體內(nèi)肝素的內(nèi)源性葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，當(dāng)其發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)時(shí)可以破壞內(nèi)皮細(xì)胞的完整性及加重子癇前期孕婦血液的高凝狀態(tài)[1]，并以此為契機(jī)引發(fā)體內(nèi)一系列的病理生理活動(dòng)。早在1976年Klein U等[4]科研小組就發(fā)現(xiàn)了Hpa這種能夠裂解ECM和BM中HSPGs、其側(cè)鏈乙酰肝素鹽及肝素的葡萄糖醛酸內(nèi)切酶，但因純化過(guò)程較為困難，使其發(fā)展一度較為緩慢。直到1999年，3個(gè)研究小組分別從血小板、胎盤(pán)和黑色素細(xì)胞瘤中克隆出一段相同的基因，提示目前發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞只表達(dá)一種能夠降解肝素的酶即Hpa[5-6]。1999年，以色列科學(xué)家Vlodavsky I等[2]成功純化出Hpa蛋白并克隆出其基因，將人類(lèi)Hpa基因定位于4q21.3，其相對(duì)分子量約為65 000，降解后分子量為50 000的蛋白片段具有活性。

Hpa能夠破壞血管內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞膜和基底膜主要構(gòu)成成分之一是糖氨聚糖，它的主要成分是HSPGs。HSPGs是一個(gè)由蛋白核心和數(shù)個(gè)與之共價(jià)連接的線(xiàn)性硫酸乙酰肝素側(cè)鏈組成[7-8]，對(duì)于細(xì)胞的完整性有至關(guān)重要的作用，Hpa通過(guò)酶解HSPGs及其側(cè)鏈[9]，可以破壞ECM和BM的完整性，同時(shí)，還可以釋放并激活各種與肝素結(jié)合的活性分子破壞血管內(nèi)皮完整性，使血管內(nèi)皮細(xì)胞就會(huì)出現(xiàn)功能障礙，同時(shí)內(nèi)皮受損會(huì)釋放出大量的炎癥介質(zhì)以及介導(dǎo)免疫反應(yīng)的活性蛋白片段，使血管內(nèi)皮源性舒張因子減少，而血管內(nèi)皮收縮因子血栓素A2產(chǎn)生增加，導(dǎo)致血管收縮因子和舒張因子比例失調(diào)，致血壓升高[9]。同時(shí)Hpa裂解HSPGs所產(chǎn)生的一系列活性蛋白片斷和其裂解肝素及其衍生物所致的血液高凝狀態(tài)，使微小血栓形成，血管阻力增高，血壓升高；同時(shí)血栓形成，血運(yùn)不暢，形成酸性環(huán)境，進(jìn)一步激活Hpa活性，形成惡性循環(huán)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，Hpa在子癇前期輕度及重度孕婦胎盤(pán)中的蛋白表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，而子癇前期重度孕婦胎盤(pán)中的Hpa蛋白表達(dá)又明顯高于子癇前期輕度，這與血壓升高趨勢(shì)相同，由此推測(cè)，Hpa與子癇前期患者血壓升高可能具有相關(guān)性。

Hpa破壞肝素與抗凝血酶Ⅲ的結(jié)合位點(diǎn)，阻礙肝素發(fā)揮抗凝作用[10]，致血液處于高凝狀態(tài)[11]。在以往研究發(fā)現(xiàn)，先兆子癇患者血清中基礎(chǔ)肝素水平及抗凝活性比正常孕婦下降50%[1]，這與本實(shí)驗(yàn)Hpa的變化趨勢(shì)是一致的。子癇前期的孕婦，血壓升高，胎盤(pán)小血管痙攣，血流量減少；血液高凝，胎盤(pán)血液流速減慢，易形成微小血栓，氣體交換受到影響，胎兒供氧不足，致胎兒生長(zhǎng)受限，胎兒窘迫，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致胎死宮內(nèi)。而同時(shí)，供氧不足所致的酸性環(huán)境更加激活了Hpa的活性，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥。本實(shí)驗(yàn)所選病例子癇前期組胎兒窘迫4例，胎死宮內(nèi)1例，胎盤(pán)早剝1例，正常對(duì)照組胎兒情況基本正常。因本實(shí)驗(yàn)樣本量有限，故Hpa與子癇前期孕婦并發(fā)癥之間的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

Hpa酶解HSPGs破壞血管內(nèi)皮后，產(chǎn)生的縮血管物質(zhì)增加，血壓升高，腎小球毛細(xì)血管痙攣，腎血流量減少，致腎缺血缺氧；Hpa降解HSPGs及HS，而HSPGs及HS是腎小球?yàn)V過(guò)膜電荷篩的主要成分，被降解后，大量陰離子丟失，腎小球?yàn)V過(guò)屏障電荷篩被破壞，即腎小球基底膜（glomerular basement membrane，GBM）多陰離子丟失，纖維蛋白沉積，內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、管腔變窄，加重腎臟的缺血缺氧；腎小球毛細(xì)血管內(nèi)凝血，微血栓形成，導(dǎo)致腎小球萎縮，引起腎損害。腎臟上述變化可致腎小球基底膜滲透性增高，血漿蛋白自腎小球漏出，腎小管重吸收功能不全而出現(xiàn)蛋白尿[12]。實(shí)驗(yàn)所選子癇前期患者依據(jù)人民衛(wèi)生出版社出版的第七版《婦產(chǎn)科學(xué)》中子癇前期的定義，患者的尿蛋白為陽(yáng)性，正常對(duì)照組尿蛋白為陰性，其中，子癇前期輕度（+），子癇前期重度組患者（++）～（++++），總體趨勢(shì)與Hpa變化一致。故Hpa蛋白表達(dá)含量增加可能是蛋白尿的產(chǎn)生原因之一，這點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13]。

綜上所述，Hpa在子癇前期孕婦胎盤(pán)中的蛋白表達(dá)水平增高可致孕婦體內(nèi)肝素水平下降及血管內(nèi)皮損傷，推測(cè)與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。隨著人們對(duì)這一物質(zhì)的認(rèn)識(shí)深入，其在婦產(chǎn)科其他領(lǐng)域的作用也在逐步被發(fā)現(xiàn)。

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