朱 寧， 張 喆， 劉 莉， 陳彥紅， 邸雪琴

(1.保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定 071000;2.河北大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，河北 保定 071000;3.河北大學附屬醫(yī)院，河北保定 071000)

心血管疾病作為臨床上的常見病、多發(fā)病，無論是發(fā)病率還是死亡率均居各類疾病之首，并已成為目前嚴重威脅人類健康的最主要疾病之一。常見的心血管疾病如心絞痛、心肌梗死、缺血性心臟病等心臟病患者不可避免的最終結局就是充血性心力衰竭，而這些疾病往往共同的病理生理基礎均是心肌缺血［1］。因此，對心血管疾病心肌損傷的病理生理機制及藥物治療靶點的研究成為當今心血管疾病的研究熱點。紅景天苷 (Salidroside)是常用的藏醫(yī)中藥紅景天的有效萃取物之一［2］，紅景天是治療高原病的常用藥材，中醫(yī)傳統理論認為其具有固本扶正、益氣活血之功效，用來治療咳血、肺炎、咳嗽與高原缺氧反應等疾病，并認為其滋補強身作用在已知補益藥中罕見的，因此紅景天享有“東方神草”、“黃金植物”的美譽，是繼人參、刺五加之后我國發(fā)現的第3種重要的保健藥用資源。紅景天苷作為其主要有效成分，研究已顯示其具有抗缺氧、抗衰老、提高腦力及體力機能等方面作用，本實驗采用N2飽和缺氧培養(yǎng)基制備心肌細胞缺氧損傷模型，觀察紅景天苷對心肌細胞的保護作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品及儀器 出生1～2 d健康SD大鼠 (北京維通利華實驗動物中心)，99%紅景天苷粉劑 (上海英軒生化試劑有限公司)，胎牛血清 (上海微科生化試劑有限公司)，胰蛋白酶 (華美生物公司)，DMEM干粉 (Gibco公司)，SOD檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，MDA檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，CO2孵箱 (北京吉諾思科貿有限公司)，SW-CJ-2FD型凈化工作臺 (蘇州安泰空氣技術有限公司)，SHZ—82恒溫水浴振蕩器 (北京凱幕生物技術有限公司)，FA21045N型電子天平 (上海精密科學儀器有限公司)，VIS—7220可見光分光光度計 (北京瑞利分析儀器公司)，TS100型倒置顯微鏡 (日本Olympus公司)，Sunris吸光酶標儀 (瑞士 SUNRIS公司)，JYD—250超聲波細胞粉碎儀 (上海京工實業(yè)有限公司)，M185706熒光分光光度計 (北京中西遠大科技有限公司)，6、24、96孔板 (Costar公司)。

1.2 心肌細胞培養(yǎng) 以Harary的方法為基礎略加改動，無菌條件下取出生后1～2 d SD乳鼠心室若干，采用0.08%胰酶消化3～4次，并收集上清液，最后加入含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基以終止消化并制成細胞懸液，放入37℃ CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)，根據心肌細胞和成纖維細胞貼壁時間的不同，采用差速貼壁55 min，以5×105/mL接種至25 mL培養(yǎng)瓶中，24 h后更換培養(yǎng)液，同時小心洗去除未貼壁細胞，再經24～48 h，待心肌細胞大部分伸展開，連成一片，同步搏動時用于實驗。

1.3 缺氧損傷模型的制備 將生長狀態(tài)良好的培養(yǎng)心肌細胞的培養(yǎng)基倒掉，以預先飽和純氮氣 (99.99%)30 min的N2飽和缺氧培養(yǎng)基沖洗兩次，取N2飽和缺氧培養(yǎng)基3 mL加入培養(yǎng)皿中，同時向皿內充氮氣20 s置換瓶內空氣，置于37℃CO2培養(yǎng)箱備用。

1.4 實驗分組與處理 心肌細胞培養(yǎng)72 h換無血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h后經不同處理后置于37℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h:①正常對照組:正常培養(yǎng)基培養(yǎng);②缺氧模型組:N2飽和缺氧培養(yǎng)基培養(yǎng);③紅景天苷低、中、高劑量組:N2飽和缺氧培養(yǎng)基同時加10 mg/L、50 mg/L、100 mg/L紅景天苷共培養(yǎng)。

1.5 檢測指標

1.5.1 MDA水平 具體方法參照超氧化物歧化酶測定試劑盒說明書操作。

1.5.2 SOD活性 具體方法參照超氧化物歧化酶測定試劑盒說明書操作。

1.5.3 SERCA活性 將心肌細胞超聲裂解后，每組取勻漿液10 μL依次置于6孔板中，每孔加入80 μL反應液 (20 mmol/L HEPES，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L MgCl2，0.01‰TritonX-100，0.8 mmol/L CaCl2，100 mmol/L KCl)，在37 ℃恒溫水浴箱預溫10 min。每孔再分別加入100 mmol/L對硝基苯磷酸 (pNPP)10 μL，37℃恒溫水浴箱中反應30 min;最后加入含55 mmol/L EDTA和500 mmol/L Tris的冷緩沖液1 mL終止反應;在波長410 nm下，測定所有樣本的吸光度，根據測得的對硝基苯酚 (PNP)標準曲線求出樣本中PNP的生成量。

1.5.4 細胞內 ［Ca2+］i用含15%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基將細胞密度調至3～5×105cells/mL，加入Fura-2/AM，終濃度為5 μmol/L，避光、振搖30 r/min、孵育30 min;1 000 r/min離心5 min，棄上清，用HEPES緩沖液沖洗兩遍。每組取細胞懸液1 mL置入熒光光度計檢測小室中，發(fā)射波長500 nm，激發(fā)波長380 nm和340 nm。

1.6 統計方法 計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析 (One-Way ANOVA)，按統計學規(guī)定P＜0.05有顯著性差異。所有統計分析均使用SPSS 16.0軟件計算分析。

2 結果

2.1 MDA水平 與正常對照組比較，缺氧模型組心肌細胞MDA水平明顯增高 (P＜0.05)，說明缺氧的心肌細胞脂質過氧化反應明顯;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量、中劑量、高劑量組心肌細胞MDA水平均降低 (P＜0.05)，且隨著藥物劑量的增加，MDA的降低呈一定的劑量依賴趨勢，見表1。

表1 各組心肌細胞MDA水平與SOD活性的比較(x ± s，n=8)

2.2 SOD活性 與正常對照組比較，缺氧模型組心肌細胞SOD活性明顯降低 (P＜0.01)，說明缺氧時心肌細胞氧自由基清除系統功能下降;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量組SOD活性有增高趨勢，但無統計學差異 (P＞0.05)，紅景天苷中、高劑量組心肌細胞SOD活性明顯增高，有統計學差異 (P＜0.05)，見表1。

2.3 SERCA活性 與正常對照組比較，缺氧模型組心肌細胞內SERCA活性明顯降低65%(P＜0.05)，說明缺氧時心肌細胞SERCA活性下降，肌漿網攝取Ca2+能力低下;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量組SERCA活性有所升高，但無統計學差異 (P＞0.05)，紅景天苷中、高劑量組心肌細胞SERCA活性明顯升高，有統計學差異 (P＜0.05)，提示SERCA活性的增高可能是紅景天苷減輕缺氧心肌鈣超載的機制之一，見表2。

表2 各組心肌細胞 SERCA活性和 ［Ca2+］i濃度比較(±s，n=8)

注:與正常對照組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與缺氧模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。

組 別 劑量/(mg·mL-1)SERCA活性(μmol·min-1·g-1pro)細胞游離Ca2+濃度/(nmol·L-1)正常對照組 —2.03±0.15 163.81±4.94缺氧模型組 — 0.69±0.02* 289.81±13.69＊＊紅景天苷低劑量組 10 0.89±0.03 200.64±6.15紅景天苷中劑量組 50 1.34±0.16# 181.82±7.64##紅景天苷高劑量組 100 1.57±0.10# 180.35±4.50##

2.4 細胞游離Ca2+濃度 與正常對照組比較，缺氧模型組心肌細胞內［Ca2+］i明顯升高了77%(P＜0.01)，說明缺氧時心肌細胞內 ［Ca2+］i濃度增高，存在鈣超載;與缺氧模型組比較，紅景天苷低劑量組［Ca2+］i有所降低，但無統計學差異 (P＞0.05)，紅景天苷中、高劑量組心肌細胞［Ca2+］i濃度均明顯降低，具有統計學差異 (P＜0.01)，但兩劑量組之間無統計學差異，見表2。

3 討論

目前氧自由基 (oxygen free radicals)損傷、細胞內鈣超載是心血管疾病心肌損傷的發(fā)病機理中兩種最主要的學說［3］。缺氧的心肌細胞損傷主要包括細胞膜、線粒體及溶酶體損傷三方面的改變［4］。細胞膜是細胞缺氧最早發(fā)生損傷的部位。缺氧時，細胞膜離子泵功能障礙、膜通透性增加、膜流動性下降和膜受體功能障礙。許多致病因子作用會造成氧自由基蓄積引起脂質過氧化物水平增高，進一步損傷心肌細胞膜系統［5］。細胞膜通透性增加，Ca2+順濃度差進入細胞內，肌漿網攝鈣速度減慢或攝鈣量減少，出現細胞內Ca2+超載，Ca2+進入線粒體形成不溶性磷酸鈣，也會加重ATP生成不足，還可以增強Ca2+依賴性蛋白激酶的活性，促進氧自由基生成，進而加重自由基對細胞的損傷［6］。Ca2+超載可激活磷脂酶，分解膜磷脂，使溶酶體膜的穩(wěn)定性降低，通透性增高，嚴重時溶酶體膜可以破裂，溶酶體內蛋白分解酶逸出引起細胞自溶，進一步損傷細胞膜和細胞器膜，溶酶體酶進入血液循環(huán)可破壞多種組織，造成廣泛的細胞損傷［7］。

細胞內外Ca2+穩(wěn)態(tài)的維持依賴于細胞膜Ca2+跨細胞膜轉運與細胞內鈣庫Ca2+釋放與攝取的動態(tài)平衡［8］。細胞膜Ca2+跨細胞膜轉運主要依賴細胞膜Ca2+通道、質膜鈣泵(即Ca2+-ATPase)以及Na+-Ca2+交換體。細胞外Ca2+內流的實現主要依賴于細胞膜上的Ca2+通道。目前研究認為細胞膜上主要有4種特異性蛋白質Ca2+通道［9］:滲透通道、機械門控式Ca2+通道、電壓依賴式Ca2+通道以及受體依賴式Ca2+通道。調節(jié)細胞內外Ca2+分布的另一個重要因素就是細胞內鈣庫對Ca2+的攝取與釋放。細胞器肌漿網富含大量Ca2+，被稱之為鈣庫。目前研究認為，心肌細胞內Ca2+濃度升高90%由肌漿網釋放，肌漿網對Ca2+的釋放與攝取是引起細胞內Ca2+濃度變化的主要原因。肌漿網Ca2+釋放主要依賴IP3受體系統和RyR受體系統，兩者均屬于受體依賴式Ca2+通道［10］。當心肌細胞興奮時，細胞膜上電壓依賴式L-型Ca2+通道開放，Ca2+順濃度差由細胞外進入細胞內，但進入的量很少不足以引起肌肉收縮，這些少量的Ca2+可以激活臨近肌漿網IP3、RyR受體通道，釋放大量Ca2+泵入胞漿，Ca2+濃度迅速升高10倍以上，大量增加的Ca2+與肌鈣蛋白C相互作用，肌鈣蛋白構型改變，促使肌球蛋白與肌動蛋白結合觸發(fā)心肌收縮。心肌收縮后胞漿內Ca2+的清除主要通過SERCA泵回到肌漿網或由細胞膜的Na+-Ca2+交換體排出細胞外，從而使胞漿內Ca2+降低，心肌細胞舒張。SERCA的主要功能就是將胞漿內Ca2+攝取入肌漿網。研究發(fā)現SERCA有多個異構體，其中SERCA2主要在心肌細胞中表達［11］。

目前紅景天苷廣泛用于臨床治療心衰、心肌缺血患者，并可提高心肌細胞對外來有毒物質免疫力。有資料證實，紅景天苷具有抗心律失常保護心肌作用，并能抑制血管平滑肌細胞的增殖與收縮。動物實驗研究顯示［12］，紅景天苷可以減少H2O2誘導體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)漏出量，抑制脂質過氧化作用，減輕心肌細胞凋亡。前期實驗已證實紅景天苷可以減少缺氧心肌細胞LDH漏出，并能抑制Ca2+與鈣調蛋白(Calmodulin，CaM)結合，來減輕鈣超載對細胞的損傷。本研究發(fā)現紅景天苷可通過提高SERCA活性，增加肌漿網Ca2+攝取功能，減輕細胞鈣超載，提示這可能是紅景天苷對缺氧心肌細胞保護作用機制之一。

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