劉 濤，李 冬，曾輝平，張 杰，

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，150090哈爾濱;2.北京工業(yè)大學(xué)水質(zhì)科學(xué)與水環(huán)境恢復(fù)工程北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100124北京)

由于上向流曝氣生物濾池具有處理效率高、占地面積小、抗沖擊負(fù)荷能力強(qiáng)等特點(diǎn)［1－2］，目前許多CANON工藝多采用此形式實(shí)現(xiàn).然而，這種反應(yīng)器作為一種推流式反應(yīng)器，由于濾池內(nèi)部自下而上各段NH4+－N負(fù)荷及其他水力條件不同，會(huì)造成濾層各段微生物的活性及群落結(jié)構(gòu)不同，從而會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)器沿程各段對(duì)NH4+－N的去除能力不同［3］.因此，需要分析內(nèi)部微生物的沿程分布規(guī)律，從而優(yōu)化工藝運(yùn)行條件.然而，目前這種類型CANON反應(yīng)器內(nèi)部的微生物沿程分布研究還鮮見報(bào)道［4－5］.由于CANON反應(yīng)器中的兩種功能細(xì)菌為氨氧化細(xì)菌(AOB)與厭氧氨氧化菌(ANAMMOX菌)［6］，相比于分離、純化等傳統(tǒng)的生物學(xué)方法，應(yīng)用顯微技術(shù)及分子生物技術(shù)研究兩類功能微生物的形態(tài)特征、群落結(jié)構(gòu)及種屬特性，能夠更有效、更準(zhǔn)確地獲得微生物方面的信息.掃描電鏡(SEM)雖然不能對(duì)微生物種群進(jìn)行直接定性，但可對(duì)系統(tǒng)內(nèi)微生物形態(tài)特征的變化進(jìn)行直觀的評(píng)價(jià).此外，在CANON工藝中，NH4+－N在氨單加氧酶(AMO)的催化作用下氧化生成羥胺(NH2OH)，這是脫氮反應(yīng)的第一步，也是極為關(guān)鍵的一步［7］，amoA基因正是編碼氨單加氧酶(AMO)活性位點(diǎn)多肽的基因［8－9］.利用amoA基因作為分子標(biāo)記可以從分子水平研究氨氧化細(xì)菌的多樣性及種屬特性［10］.對(duì)于厭氧氨氧化微生物來說，應(yīng)用其特異性引物擴(kuò)增16SrDNA作為標(biāo)記可以研究其種群結(jié)構(gòu)［11］.

本文研究上向流曝氣生物濾池型CANON反應(yīng)器中功能微生物種群結(jié)構(gòu)及種屬特性的沿程變化規(guī)律，以便更合理地設(shè)置功能分區(qū)、優(yōu)化設(shè)計(jì)參數(shù)，提高脫氮效果.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 CANON反應(yīng)器及樣品采集

上向流曝氣生物濾池型CANON反應(yīng)器如圖1所示.反應(yīng)器內(nèi)徑150mm，有效高度700mm，總?cè)莘e8.15L，有效體積1.8L，柱內(nèi)裝填火山巖活性生物陶粒濾料.以NaHCO3、(NH4)2SO4、KH2PO4與自來水配制進(jìn)水氨氮為300mg/L左右原水，從反應(yīng)器底部進(jìn)入，由上部出水口排出，在整個(gè)過程中，溫度一直保持在16～20℃.

圖1 CANON反應(yīng)器試驗(yàn)裝置及工藝流程圖

在反應(yīng)器連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行第28天，分別從反應(yīng)器濾層由上至下100、300、500和700 mm處采集濾料若干，將樣品保存于－20℃冰箱中用以提取基因組DNA.

1.2 掃描電鏡觀察

取不同濾層高度采集的濾料少許，經(jīng)戊二醛固定、乙醇梯度脫水、乙酸異戊酯置換、臨界點(diǎn)干燥、離子濺射噴金處理后使用日立S－4300型掃描電鏡儀對(duì)樣品進(jìn)行觀察并拍照.每個(gè)樣品隨機(jī)拍攝5～10張照片.

1.3 基因組DNA的提取

用無菌玻璃棒攪拌濾料以使生物膜脫落，稱取1g濕質(zhì)量的生物膜，加入2.7mLDNA提取液(100mmol/LTris-HCl，100mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，1.5mol/LNaCl，100mmol/LNa3PO3，1%CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)，pH8.0)，并加入50μL蛋白酶K(30g/L)，50μL溶菌酶(20g/L)以及數(shù)粒玻璃珠，37℃水浴30min.此后加入1.5mLSDS(十二烷基硫酸鈉)溶液(200g/L)，65℃水溶2h，期間每隔20min上下顛倒混勻一次.8000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，并加入等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，混勻，8000g離心10min后將上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，并加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，－20℃過夜保存.12000g離心5min，棄上清，再以同樣的轉(zhuǎn)速離心3min，棄上清液并將樣品置于通風(fēng)處徹底晾干，之后用50μL1×TEbuffer(10mmol/LTris-HCl;1mmol/LEDTA，pH8.0)溶解.所提取的基因組DNA結(jié)果用0.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)以備PCR用.

1.4 PCR擴(kuò)增及DGGE電泳

用引物amoA-1F和amoA-2R［12］擴(kuò)增氨氧化細(xì)菌amoA基因.其中amoA-1F的5＇端所加GC夾子為DGGE設(shè)計(jì);對(duì)于ANAMMOX菌的特異性片段的擴(kuò)增采用巢式PCR方法:第一階段先用細(xì)菌的通用引物27F/1492R［13］進(jìn)行16SrDNA序列的PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，之后以第一階段的PCR產(chǎn)物為模板，以ANAMMOX菌的特異性引物對(duì)Amx368F/Amx820［14］進(jìn)行第二階段的PCR擴(kuò)增，Amx368F的5＇端加GC夾子同樣為后續(xù)DGGE所設(shè)計(jì).PCR反應(yīng)體系為25μL，其中包含2.5μL10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)，dNTP2.0μL，引物各1.0μL，TaKaRaExTaq酶0.625U，模板DNA約1.0ng，用無菌水補(bǔ)齊至25μL.各種引物序列及PCR反應(yīng)條件見文獻(xiàn)［12-14］.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè).

采用北京天根公司DNA膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化回收，具體操作按說明書進(jìn)行.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析:聚丙烯酰胺質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%，變性梯度為30%～60%，電壓120V，電泳時(shí)間5h，PCR產(chǎn)物上樣量約500ng，電泳在Dcode UniversalMutation Detection System儀器上進(jìn)行.電泳結(jié)束后用Bassam等［15］的方法對(duì)凝膠進(jìn)行銀染，并對(duì)凝膠拍照.

1.5 基因文庫的構(gòu)建、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

切取DGGE圖譜中的目的條帶溶于50μLTE(pH8.0)溶液中，4℃過夜，以此為模板，以不含GC夾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化.按照pMD19-Tplasmidvectorsystem說明書進(jìn)行基因片段與載體的連接后，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑法篩選陽性克隆子并進(jìn)行測(cè)序.采用BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果和基因庫中已知序列進(jìn)行相似性分析，并利用MEGA4.0軟件，采用鄰位相連法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉值為1000.

2 結(jié)果與討論

2.1 穩(wěn)定運(yùn)行時(shí)的脫氮效果

反應(yīng)器在常溫、進(jìn)水氨氮為300 mg/L條件下，通過調(diào)節(jié)曝氣及水力停留時(shí)間實(shí)現(xiàn)了CANON的穩(wěn)定運(yùn)行，并連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行約30 d.取樣時(shí)反應(yīng)器運(yùn)行工況為:進(jìn)水氨氮質(zhì)量濃度300 mg/L，溫度18℃，曝氣量4.5 L/min，氨氮去除率達(dá)83%，氨氮去除負(fù)荷為1.4kg/(m3·d)，總氮去除率75%，總氮去除負(fù)荷1.1kg/(m3·d)，出水硝氮濃度維持在20～35mg/L.盡管得到的總氮去除負(fù)荷略低于Sliekers以及Chuang等的研究［16-17］，但依然屬于較高的去除負(fù)荷，因此，分析在該運(yùn)行工況下的微生物沿程分布特點(diǎn)更具有代表性.

2.2 電鏡(SEM)照片

由于氨氧化細(xì)菌和厭氧氨氧化細(xì)菌形態(tài)多樣，一般難以通過形態(tài)來區(qū)分和鑒定其種屬.污水處理廠經(jīng)常出現(xiàn)的氨氧化細(xì)菌主要是亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，其形態(tài)分別呈球狀和短桿狀，而亞硝酸鹽氧化菌主要是硝化螺菌屬(Nitrospira)和硝化桿菌屬(Nitrobacter)，形態(tài)分別呈螺旋狀和桿狀［18］.過去曾報(bào)導(dǎo)厭氧氨氧化菌為規(guī)則或者不規(guī)則的球形和橢球形，單生或成簇聚生［19］，直徑約0.8～1.1 μm.因此，圖2中的球菌和橢球菌可能為亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和厭氧氨氧化細(xì)菌，短桿菌可能為亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，而長桿菌可能為硝化桿菌屬(Nitrobacter).

由圖2可見，顯微鏡下可檢測(cè)到長桿菌、短桿菌、球菌和橢球形的菌，其中直徑0.2～1.0μm的橢球形和球形菌為優(yōu)勢(shì)菌，幾乎未檢測(cè)到螺旋狀細(xì)菌，而長桿菌所占的比例也很低，說明反應(yīng)器中亞硝酸鹽氧化菌含量很低，這也保證了反應(yīng)器中的亞氮幾乎不會(huì)被硝酸鹽氧化菌利用，從而得到有效積累，為后續(xù)的厭氧氨氧化創(chuàng)造條件.圖2(a)中微生物數(shù)量較少，多數(shù)為單生，并未成簇聚生;在濾層300mm處，細(xì)菌數(shù)量增加，且出現(xiàn)了聚集生長的趨勢(shì)(圖2(b));隨著濾層深度的增加，微生物數(shù)量明顯增多(圖2(c)、(d))，且成簇聚生，其中以橢球形和球形菌為主，但也存在數(shù)量可觀的短桿菌.這些細(xì)菌可能為氨氧化細(xì)菌和厭氧氨氧化菌，其種屬特性將通過接下來的分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證.

圖2 不同濾層高度樣品的電鏡照片

2.3 PCR-DGGE圖譜及系統(tǒng)發(fā)育分析

由于PCR-DGGE圖譜中的每一條帶代表一個(gè)可能的細(xì)菌類群或可操作分類單位(OTU)，條帶的數(shù)量和信號(hào)強(qiáng)度與生物多樣性和生物數(shù)量密切相關(guān)，基于PCR-DGGE圖譜可以確定不同取樣處微生物的種類和數(shù)量關(guān)系.

不同高度采集樣品的DGGE分析見圖3.氨氧化細(xì)菌在100和300mm處的可見條帶只有3條，而在500和700mm處條帶數(shù)量明顯增多，條帶信號(hào)明顯增強(qiáng)，說明氨氧化細(xì)菌在濾層500mm處以下的種類和數(shù)量明顯增多，這與掃描電鏡試驗(yàn)的結(jié)果一致.其原因可能為:由于反應(yīng)器采用上向流曝氣，而氨氧化細(xì)菌是一種嚴(yán)格的好氧細(xì)菌，在反應(yīng)器底部曝氣量充足，有利于其生長.而富含氨氮基質(zhì)的進(jìn)水也是從反應(yīng)器底部進(jìn)入，氨氮會(huì)率先供給下部的氨氧化細(xì)菌.隨著反應(yīng)器內(nèi)溶解氧和氨氮被利用，在反應(yīng)器上部的氨氧化細(xì)菌受到抑制，從而造成種類和數(shù)量的下降.此外，水力沖刷作用導(dǎo)致上部生物膜在一定程度上的破壞也是造成這種現(xiàn)象的原因之一.Purkhold等研究表明:污水處理系統(tǒng)中氨氧化細(xì)菌的多樣性程度越高，對(duì)復(fù)雜環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，其抗沖擊能力也就越強(qiáng);反之，如果系統(tǒng)中只含有單一的氨氧化細(xì)菌，其抗干擾能力就較差［10］.在本實(shí)驗(yàn)所用的CANON反應(yīng)器中，500 mm以下處的氨氧化細(xì)菌的多樣性程度很高，具有較強(qiáng)的抗沖擊負(fù)荷.然而在300mm以上的位置，氨氧化細(xì)菌多樣性很低，抗干擾能力較差.因此，為了提高濾層上部區(qū)域的抗沖擊負(fù)荷，需要采取一定措施提高氨氧化細(xì)菌的多樣性程度，其中最直接的做法就是對(duì)濾料進(jìn)行重新排布.考慮到火山巖生物陶粒濾料填充的CANON反應(yīng)器內(nèi)已經(jīng)形成穩(wěn)定的氣道，重新排布濾料可能會(huì)破壞系統(tǒng)內(nèi)的好氧/厭氧區(qū)域分布，進(jìn)而破壞功能微生物的穩(wěn)定性，影響系統(tǒng)的脫氮性能，可改用便于排布的軟性填料，比如海綿、無紡布等.但是它們對(duì)細(xì)菌的持留能力可能低于火山巖生物陶粒濾料，從而使CANON的啟動(dòng)時(shí)間延長，具體解決方案還需進(jìn)一步研究.

對(duì)于ANAMMOX菌來說，4個(gè)取樣點(diǎn)的DGGE圖譜基本一致，而且只有兩條可見條帶，說明ANAMMOX菌的群落結(jié)構(gòu)在整個(gè)反應(yīng)器中基本一致，幾乎不隨濾層高度的變化而變化.此外，條帶6的信號(hào)沿濾層自上而下有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)，也說明ANAMMOX菌在反應(yīng)器下方的數(shù)量要略多于上方.原因可能在于反應(yīng)器上部氨氧化細(xì)菌種類和數(shù)量的減少，不能為ANAMMOX菌很好地創(chuàng)造厭氧環(huán)境，也不能提供ANAMMOX菌代謝所需足夠的亞硝酸鹽.此外，水力沖刷作用導(dǎo)致上部生物膜一定程度的破壞也是造成這種現(xiàn)象的原因之一.值得注意的是，通過條帶信號(hào)的強(qiáng)弱只能粗略推測(cè)細(xì)菌數(shù)量的多少，要想更精確地檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量，還需要通過熒光定量PCR等其他檢測(cè)手段.

圖3 PCR產(chǎn)物DGGE圖譜沿程分布

對(duì)DGGE圖譜上的7條主要條帶進(jìn)行切割、DNA洗脫、回收、重新擴(kuò)增，構(gòu)建基因克隆文庫，經(jīng)測(cè)序所得的DNA序列提交至GenBank，得到的GenBank序列號(hào)為JN367453-JN367457以及JQ753318.對(duì)測(cè)序結(jié)果和基因庫中已知序列進(jìn)行相似性對(duì)比分析，結(jié)果見表1.由于條帶6和7之間相似度達(dá)98%，可以歸并為一個(gè)可操作分類單位(OTU)，它們與Candidatus Kuenenia stuttgariensis相似度達(dá)98%.這些已知細(xì)菌的形態(tài)多為球形、橢球形和短桿狀，與前文掃描電鏡結(jié)果一致.

表1 7個(gè)條帶所代表的基因序列對(duì)比結(jié)果

基于amoA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，樹圖的外源基因?yàn)?種常見的氨氧化微生物，即亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)以及一些未培養(yǎng)的氨氧化細(xì)菌.從圖4可知，條帶3與亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)處于一個(gè)分枝上，其余4個(gè)條帶均與亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)的親緣關(guān)系較近，與亞硝化葉菌(Nitrosolobus)、亞硝化螺菌(Nitrosospira)的遺傳距離較遠(yuǎn).由于所研究的反應(yīng)器進(jìn)水氨氮濃度為300 mg/L，屬于較高的氨氮環(huán)境，在該條件中檢測(cè)到亞硝化球菌(Nitrosococcus)的存在，這與前人報(bào)道的亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)在高氨氮環(huán)境中作為氨氧化細(xì)菌的結(jié)果吻合［20］.此外，系統(tǒng)中還存在亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)，它是許多水生態(tài)系統(tǒng)中最常見的氨氧化菌類型［7］.

從圖3(a)不同泳道的條帶變化情況來看，亞硝化球菌(Nitrosococcus)僅出現(xiàn)在濾層100及300mm處，而與亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)相關(guān)的條帶1、條帶2所代表的氨氧化細(xì)菌僅在濾層下方出現(xiàn).如何根據(jù)這些細(xì)菌的空間分布特點(diǎn)改進(jìn)工藝條件以達(dá)到更好的脫氮效果，還有待于進(jìn)一步的研究.

基于ANAMMOX菌16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5.樹圖的外源基因選取了常見的幾種ANAMMOX菌.可以看出，條帶6、7與Candidatus Kuenenia stuttgariensis遺傳距離最近，這與之前報(bào)道的在一個(gè)特定的環(huán)境條件中，只可能有一種ANAMMOX菌會(huì)成為優(yōu)勢(shì)菌種的結(jié)果相一致［21］.Candidatus Kuenenia stuttgariensis屬于浮霉菌屬，是污水處理系統(tǒng)中除Candidatus Brocadia anammoxidans之外的典型的具有厭氧氨氧化活性的微生物［22－24］.存在于本系統(tǒng)中的ANAMMOX菌是CandidatusKueneniastuttgariensis而非Candidatus Brocadia anammoxidans，其原因在于本實(shí)驗(yàn)所用污水是用自來水加一定的無機(jī)鹽配制而成，具有較高的鹽離子濃度，而Candidatus Kuenenia stuttgariensis被認(rèn)為是一種存在于淡水環(huán)境中，并對(duì)較高的鹽離子濃度具有一定耐受性的ANAMMOX菌［21］，因此，Candidatus Kuenenia stuttgariensis成為系統(tǒng)中的優(yōu)勢(shì)ANAMMOX菌.

圖4 基于amoA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 基于ANAMMOX菌16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

1)上向流曝氣生物濾池型CANON反應(yīng)器中，濾層下方的氨氧化細(xì)菌的種類和數(shù)量遠(yuǎn)高于濾層上部;厭氧氨氧化菌的多樣性幾乎不隨濾層高度發(fā)生變化，其數(shù)量沿著濾層自上而下有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì).

2)反應(yīng)器中微生物形態(tài)多樣，易成簇生長，其中以直徑0.2～1.0 μm的球形及橢球形菌為主.

3)DNA測(cè)序結(jié)果表明，亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)是反應(yīng)器中的主要氨氧化細(xì)菌，而厭氧氨氧化菌與Candidatus Kuenenia stuttgariensis的相似度高達(dá)98%.

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