覃勇榮，馮濟梅，梁文忠，李秋明，劉旭輝

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量動態(tài)分析

覃勇榮，馮濟梅，梁文忠，李秋明，劉旭輝

(河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，廣西宜州546300)

采用水培試驗方法，分別研究了不同濃度重金屬鎘脅迫背景下，添加或不添加EDTA處理的桑苗葉片丙二醛含量45 d的動態(tài)變化。實驗結(jié)果表明:(1)桑苗葉片的丙二醛含量與鎘濃度有關(guān)，在21 d～27 d內(nèi)，丙二醛含量呈波動上升趨勢，之后呈波動下降趨勢;(2)與不添加EDTA的對照組比較，加入EDTA處理的桑苗葉片丙二醛含量波動比較平緩，隨鎘脅迫時間的增加，其葉片中的丙二醛含量緩慢增加;(3)低濃度的鎘離子對桑苗生長有一定的促進作用，但濃度較高時會對其造成一定的傷害，使其生長受到抑制，葉片變黃，萎蔫，甚至死亡;(4) EDTA能適當緩解鎘離子對桑苗的傷害。

桑樹幼苗;重金屬;鎘脅迫;丙二醛含量

廣西礦產(chǎn)資源豐富，享有“有色金屬之鄉(xiāng)”的美譽。過去，由于資金缺乏或者技術(shù)落后，礦業(yè)開發(fā)不可避免地對周邊環(huán)境造成一定的影響。近年來，隨著東桑西移及農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，廣西已成為我國重要的桑蠶種養(yǎng)基地。但是，礦區(qū)及其周邊環(huán)境重金屬污染的風險依然存在。殘留于土壤中的重金屬元素可參與到水體—土壤—生物的系統(tǒng)循環(huán)，也可以通過植物的吸收或動物的取食進入食物鏈，從而影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)的安全［1－3］。所以，篩選抗性強、適應(yīng)性廣的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)桑樹品種，對廣西桑蠶產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義［4］。

鎘是一種有毒的重金屬，也是自然界的一種主要污染源，鎘脅迫嚴重影響植物的生長發(fā)育，降低作物的產(chǎn)量和質(zhì)量［5］。研究表明，高濃度的鎘能誘導(dǎo)過量活性氧的產(chǎn)生，破壞細胞的氧化還原狀態(tài)和細胞膜的穩(wěn)定性，干擾細胞的正常代謝［6］，鎘在土壤中的高毒性更令人擔憂［7］。

螯合劑對金屬離子有很強的螯合能力，能增大土壤中重金屬的溶解度，促進重金屬在植物地上部的積累。近年來，利用螯合劑輔助植物提取的技術(shù)(Chelate－assistedphyto－extraction)備受青睞。陳亞華等人研究發(fā)現(xiàn)，游離態(tài)的Pb或EDTA對幼苗具有毒害作用，而螯合態(tài)的Pb－EDTA基本不具有生物毒性［8，9］?？梢姡谶m當濃度的EDTA作用下，重金屬對植物的生理脅迫可能會有一定程度的緩解。因為植物對重金屬脅迫有一定的耐性，同時也會產(chǎn)生一定的抗逆性。所以，了解植物對重金屬脅迫的抗逆機理、耐受重金屬的濃度范圍及產(chǎn)生適應(yīng)性所需時間，可以在重金屬污染的土壤篩選合適的修復(fù)植物，或者種植耐性較強、經(jīng)濟價值較高的作物，充分利用有限的土地資源，發(fā)揮最大的生態(tài)經(jīng)濟效益。

關(guān)于重金屬污染對植物影響的相關(guān)研究，大多集中在探討植物對重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運、累積，以及重金屬對植物光合作用和呼吸作用的影響等方面。關(guān)于鎘對小麥、玉米等作物生長發(fā)育及其生理生化影響的研究相對較多［10－12］，而關(guān)于重金屬對桑蠶的生長、產(chǎn)量及毒性機理等方面的研究報道甚少，關(guān)于鎘等重金屬對廣西桑蠶產(chǎn)業(yè)影響的研究亦鮮有報道［13］。以桑樹幼苗為實驗材料，采用水培方法，模擬不同濃度的重金屬鎘脅迫，采取添加或者不添加螯合劑EDTA兩種不同的處理方式，分析不同濃度重金屬鎘脅迫背景下，桑樹幼苗葉片MDA含量隨時間動態(tài)變化的特征，可以了解桑樹幼苗的受害過程及機理，為減輕鎘等重金屬對桑樹的危害，提高桑蠶及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究的實驗材料——桑樹幼苗品種為特優(yōu)二號，苗齡45d，由廣西宜州市城南廣場桑苗批發(fā)部提供，均未受到有害物質(zhì)的污染。

1.2 儀器與試劑

實驗儀器:AL204型電子分析天平(梅特勒—托科多儀器上海有限公司);80－2型臺式電動離心機(常州國華電器有限公司);CFA－160型微電腦光波電熱爐(茂名市恒聲電器有限公司);722N型可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);101－2－BS型臺式恒溫干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);UV－1800型紫外－可見分光光度計(上海:島津國際貿(mào)易有限公司);艾柯DZG－303A型純水儀(臺灣艾柯成都康寧試驗專用純水設(shè)備廠);華燁HYP－1040型四十孔消化爐﹙上海纖檢儀器有限公司﹚;pHS－3C型pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);FZ－102型微型植物樣品粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

主要試劑:Cd(NO3)2、EDTA、Ca(NO3)2、ZnSO4、KNO3、(NH4)3PO4、MgSO4、Fe3+、微量元素。鎘標準液、二甲酚橙、六亞甲基四胺、無水乙醇、乳化劑OP、磷酸二氫鈉、硼砂、三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)、2－硫代巴比妥酸(2－thiobarbituric acid，TBA)。

以上試劑除2－硫代巴比妥酸(C4H4N2O2S)為生化試劑(BR)外，均為分析純(AR)，實驗用水為去離子水。

1.3 實驗方案

1.3.1 材料處理

選擇外觀大小、規(guī)格基本一致的健壯桑苗，先用清水把根部的泥沙洗滌干凈，然后用KMnO4溶液浸泡10min，再用去離子水清洗干凈，備用。

1.3.2 水培試驗

用盆栽模擬法［14］，以4L/盆Hoagland營養(yǎng)液作為培養(yǎng)液，設(shè)不同Cd2+濃度處理，以不添加EDTA的桑樹幼苗水培試驗作對照。因為高濃度的重金屬離子脅迫很快會使桑苗死亡，所以，根據(jù)筆者前期進行的預(yù)備實驗結(jié)果并參考有關(guān)文獻，水培液中的Cd2+濃度分別設(shè)為0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0mg/L，EDTA的濃度均為0.55mmol/L。重金屬Cd2+用Cd(NO3)2配制，Cd2+濃度以純金屬離子計算［15，16］。加入重金屬Cd2+后，以3d為一個時間間隔，分別取樣測定桑樹幼苗基部葉片的丙二醛含量。培養(yǎng)幼苗時，每種不同的實驗處理均設(shè)三個重復(fù)，以保證樣品測試時材料的供應(yīng)和數(shù)據(jù)的可靠性。

1.3.3 丙二醛及鎘含量的測定

(1)丙二醛含量的測定用硫代巴比妥酸法［17］。

(2)鎘含量的測定用HNO4－HClO4消化，二甲酚橙分光光度法［18］，實驗材料為培養(yǎng)45d的桑樹幼苗。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理用Microsoft Excel 2003和SPSS18.0軟件進行，每個樣品均做三個平行測定，結(jié)果取平均值。利用單因子方差分析(one－way ANOVA)和最小顯著差數(shù)法(LSD)，對不同樣品的測定數(shù)據(jù)進行比較和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的Cd2+對桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

圖1為水培液中不添加EDTA時，桑樹幼苗在各種不同濃度Cd2+脅迫的情況下，其葉片丙二醛含量的測定結(jié)果。由圖1可看出，隨著Cd2+濃度的升高，丙二醛含量呈上升趨勢。加重金屬鎘6d后，丙二醛含量明顯低于3d后的含量，可能是桑樹幼苗對重金屬鎘脅迫產(chǎn)生生理抗逆性的結(jié)果。在加入Cd2+后的21～27d時間內(nèi)，大部分桑樹幼苗葉片的丙二醛含量呈逐漸上升趨勢，之后變化較平緩，說明桑苗在經(jīng)歷重金屬鎘脅迫一段時間后，有了一定的有適應(yīng)性。加入Cd2+濃度為250、200、150、100、50mg/L脅迫處理的桑苗，分別在第12d、30d、30d、30d、36d摘不到葉子，說明隨著重金屬離子濃度的增高，鎘對桑樹幼苗的生長產(chǎn)生了明顯的抑制作用。通過每天的觀察記錄得知:隨著Cd2+濃度提高和時間的推移，桑樹幼苗葉片褪綠、變黃、枯槁及萎蔫的現(xiàn)象越明顯，因此也越難長成葉子，甚至一些幼苗逐漸出現(xiàn)死亡癥狀。從桑樹幼苗丙二醛含量的分析結(jié)果來推斷，低濃度的Cd2+可能對桑樹幼苗的生長有一定的促進作用，但高濃度的Cd2+對桑樹幼苗生長卻能產(chǎn)生明顯的毒害作用。

圖1 不同濃度的Cd2+對桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

2.2 EDTA對鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

圖2為水培液中添加EDTA時，桑樹幼苗在各種不同濃度Cd2+脅迫下，其葉片丙二醛含量的測定結(jié)果。由圖2可看出，加入EDTA的桑樹幼苗在重金屬Cd2+的脅迫下，隨著時間的推移，其葉片中的丙二醛含量稍有上升。通過對圖1和圖2的比較可知，前者丙二醛含量大多為0.015μmol/g左右，而后者的丙二醛含量則大多在0.015μmol/g之下。空白對照組與單獨加EDTA的實驗處理組相比，加EDTA處理組的丙二醛含量明顯高于空白對照組。

圖2 EDTA對鎘脅迫下的桑樹幼苗葉片丙二醛含量的影響

2.3 桑樹幼苗葉片丙二醛含量與其體內(nèi)Cd2+含量的關(guān)系分析

圖3為不添加EDTA水培45d，桑苗葉片丙二醛含量與桑苗中鎘含量的比較?？梢?，桑樹幼苗的鎘含量隨著培養(yǎng)液中的Cd2+濃度增大而逐漸升高，丙二醛含量與桑樹幼苗吸收的鎘成正相關(guān)(r=0.83，p＜0.01)。當培養(yǎng)液中Cd2+為250mg/L時，隨著桑樹幼苗對鎘離子吸收的增加，MDA含量卻明顯下降，其原因有待研究。

圖3 桑苗葉片丙二醛含量與桑苗吸收Cd2+的情況比較

2.4 EDTA處理對桑苗葉片丙二醛含量及其體內(nèi)Cd2+含量的關(guān)系分析

圖4為添加EDTA水培45d，桑苗葉片丙二醛含量與桑樹幼苗中鎘含量的比較。值得注意的是，在培養(yǎng)液中的Cd2+濃度為200mg/L時，桑苗對鎘離子吸收量最大(此時其桑苗葉片中的丙二醛的含量也達到一個峰值)，說明桑樹幼苗對重金屬鎘的吸收是一個十分復(fù)雜的過程，許多問題尚有待進一步研究。

圖4 添加EDTA處理對桑苗葉片丙二醛含量及其體內(nèi)吸收Cd2+的影響

3 討論

植物生理生化研究結(jié)果表明，植物細胞損傷過程中，生物膜的破壞是由細胞產(chǎn)生的超氧自由基誘導(dǎo)脂質(zhì)中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用造成的［19］。丙二醛的積累來自不飽和脂肪酸的降解，它的生成是植物體內(nèi)自由基引發(fā)而產(chǎn)生的，丙二醛的積累能夠反映植物體內(nèi)自由基的活動狀態(tài)［20］。因此，在植物逆境生理研究中，丙二醛被普遍地作為一種表示傷害的指標。在本試驗中，在重金屬鎘脅迫下，隨著水培液中的Cd2+濃度升高，桑樹幼苗葉片細胞損傷程度增加，丙二醛含量增多。高濃度的Cd2+脅迫，桑苗受害嚴重，甚至死亡。本實驗的結(jié)果與鄭世英、鄭愛珍等相關(guān)研究的結(jié)果相一致［21，22］。由本試驗結(jié)果可知，單獨加EDTA對植物細胞也有一定損害。在重金屬離子存在的情況下，加入EDTA能促進了桑苗對鎘的吸收，鎘與EDTA螯合，可降低其對桑樹幼苗的毒害作用，這與陳亞華等對螯合態(tài)的Pb－EDTA作用于油菜幼苗的結(jié)果相似［8，24］。一般情況下，植物吸收的重金屬主要積累在根部，然而這種現(xiàn)狀也會受到重金屬濃度的限制，隨著重金屬處理濃度的升高，重金屬離子在其體內(nèi)積累量逐漸增加，從而對植物的毒害作用加劇，重金屬脅迫使植物細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧自由基超過保護酶系統(tǒng)的清除能力時，就會導(dǎo)致自由基在葉細胞內(nèi)的大量積累，從而誘導(dǎo)對植物細胞的過氧化傷害［23］。這也表明重金屬脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)對植物細胞的保護作用是有限度的。本研究發(fā)現(xiàn)，桑樹幼苗對重金屬Cd2+具有一定的耐性，在桑苗培養(yǎng)的過程中，在一定的濃度范圍內(nèi)，桑樹幼苗能夠耐受脅迫，生長良好，很少死苗現(xiàn)象。至于桑樹幼苗對其他重金屬離子脅迫的抗逆機理，以及EDTA對其他重金屬毒害是否也有降解作用，目前還不甚明了，有待進一步研究。

4 結(jié)論

根據(jù)實驗研究結(jié)果及以上分析討論，可以初步得到以下結(jié)論:

(1)桑樹幼苗對重金屬鎘具有一定的耐性。但是，在Cd2+的脅迫下，桑樹幼苗細胞膜受損，丙二醛含量升高。(2)低濃度的Cd2+對桑樹幼苗生長有一定的促進作用，但Cd2+濃度大于50mg/L時，對桑苗生長有毒害作用。(3)桑樹幼苗對Cd2+的吸收是一個復(fù)雜的過程，其葉片中的丙二醛含量及體內(nèi)的Cd含量并非與水培液中的Cd2+濃度成正相關(guān)，但是，其葉片中的丙二醛含量與莖葉中的鎘含量成正相關(guān)。(4)EDTA促進了桑苗對Cd2+的吸收，對緩解重金屬鎘的毒害具有一定的作用。

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［責任編輯劉景平］

Dynam ic Analysis of Malondialdehyde Content inMorus AlbaSeed ling Leaves Under Cd2+Stress

QIN Yong－rong，F(xiàn)ENG Ji－mei，LIANG W en－zhong，LIQiu－m ing，LIU Xu－h(huán)ui
(Department of Chem istry and Life Science，Hechi University，Yizhou，Guangxi546300，China)

By water－implantation experiment，different concentrations of Cd2+are added to the nutrient solution respectively．In each solution of one group，treatmentwith 0.55 mmol/L EDTA is compared to the other groups untreated with EDTA．The dynamic changes ofmalondialdehyde(MDA)content in theMorusalbaleaves for 45 days are investigated．The results show that:(1)there are some relationship between MDA contents inMorusalbaleaves and Cd2+concentration in the solution．During the period of21 to 27days，MDA contentof the leaves has a rising trend of fluctuation at first，and then declines in a fluctuating state;(2)Compared with the groups untreated with EDTA，MDA content in the leaves not only remains at a relative stable level，but also increases gradually with time prolonging;(3)When Cd2+concentration is ata lower level，itwill promote the growth ofMorus albaseedling，butwhen Cd2+concentration is at a higher level，such poisonous effects will happen，that is，the growth of the seeding will be inhibited，and the leaves of seedingswill turn yellow or wither;(4)EDTA can alleviate Cd2+poisonous effects onMorusalbaseedlings．

Morusalbaseedling;heavymetal;Cd2+stress;malondialdehyde content

book=0,ebook=51

X53

A

1672－9021(2012)02－0017－06

覃勇榮(1963－)，男，廣西平南人，河池學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系教授，主要研究方向:高校生物學(xué)教學(xué)，巖溶地區(qū)生態(tài)修復(fù)。

廣西高校重點建設(shè)學(xué)科基金資助項目(桂教科研〔2007〕20號);廣西高校重點實驗室基金資助項目(桂教科研〔2010〕6號);廣西高等學(xué)校特色課程及專業(yè)一體化建設(shè)基金資助項目(桂教高教〔2011〕102號)。

2012－03－11