楊培培，王 穎，胡繼明，楊瑞梅，張傳美，韓先杰，黃 娟，孫月平，秦曉冰，單 虎

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）也稱(chēng)綠膿桿菌（Bacillus pyocyaners），是一種條件致病菌，該菌廣泛存在于自然環(huán)境中、人和動(dòng)物的腸道、皮膚[1]。近年來(lái)，由PA引起的動(dòng)物疫病有上升趨勢(shì)，我國(guó)山東省是水貂養(yǎng)殖大省，不斷有養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)大規(guī)模PA原發(fā)病的報(bào)道，給水貂養(yǎng)殖戶(hù)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。臨床證明，該菌對(duì)大多數(shù)防腐劑和抗菌藥物表現(xiàn)為天然或獲得性多重耐藥，所致感染可供選擇的有效抗菌藥物很少，困擾著臨床PA病的治療[3]。因此，預(yù)防PA的感染尤為重要。

PA的鞭毛蛋白能夠與粘蛋白、糖脂脫唾液酸以及Toll樣受體5結(jié)合而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，在連接天然免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中起重要作用，顯示PA鞭毛蛋白具有良好的免疫原性[4-6]。鞭毛蛋白基因（flic）編碼的鞭毛蛋白是PA鞭毛絲狀部的主要蛋白，具有較強(qiáng)的抗原性，flic作為一種疫苗候選分子備受關(guān)注[7]。因此，本研究克隆兩株水貂PA的flic基因，并與國(guó)外分離株進(jìn)行序列分析及比較，為PA基因工程疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和載體 2009年～2011年山東地區(qū)分離的PA菌株29株、E.coliDH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存；pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 酶類(lèi)及主要試劑 ExTaqDNA聚合酶、限制性?xún)?nèi)切酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 細(xì)菌鞭毛分型 分析比較GenBank登錄的PAfilc基因序列，根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì)分型引物，上游引物：5'-GCCTGCAGATCTCCAACC-3'，下游引物：5'-GGCAGCTGGTTAGCCTG-3'。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以細(xì)菌DNA為模板，擴(kuò)增flic基因的部分片段，根據(jù)片段大小確定鞭毛類(lèi)型。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與目的基因擴(kuò)增 根據(jù)GenBank中登錄的PA A型（EF418192.1）和B型（U54775.1）菌株flic基因序列，分別設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，擴(kuò)增兩型代表株P(guān)ASD01和PASD03flic的全基因，預(yù)期擴(kuò)增片段 1 164 bp或 1 185 bp和 1 467 bp。A型flic，上游引物：5'-GGATCCATGGCCTTGACCGTC AACA-3'，下游引物：5'-CTCGAGGCGCAGCAGG CTCAGAAC-3'；B型flic，上游引物： 5'-GGATCC ATGGCCCTTACAGTCAACACGA-3'，下游引物：5'-CTCGAGGCGCAGCAGGCTCAGGAC-3'。上游引物和下游引物分別引入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。以提取的細(xì)菌分離株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5flic基因的克隆與鑒定 分別回收PCR產(chǎn)物，將其與pMD18-T連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，將鑒定正確的重組質(zhì)粒分別命名為pMD-flicA和pMD-flicB。

1.6flic全基因的序列測(cè)定及分析 將重組質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測(cè)序，利用DNAstar6.0 MegAlign軟件，將flic基因的核苷酸序列與GenBank登錄的序列進(jìn)行比對(duì)分析。參考序列菌株分別為CF5（AY275674.1）A型、PACF01（EF418192.1）A型、8821M （GU060499.1）A型、LESB58（FM 209186.1）B型、PACF48（EF418194.1）B型、PACF40（EF418193.1）B型、UCBPP-PA14（CP000438.1）B型、PA01（U54775.1）B型、PA01（U54775.1）B型。

2 結(jié)果與討論

2.1 29株分離株鞭毛分型結(jié)果 以提取的29個(gè)分離菌基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，預(yù)期得到1 000 bp左右的片段為A型，得到1 300 bp左右的片段為B型，電泳結(jié)果與預(yù)期產(chǎn)物大小相符（圖1和圖2）。29株分離株中，18株為A型，11株為B型。其中1號(hào)菌株P(guān)ASD01為A型鞭毛菌株，3號(hào)菌株P(guān)ASD03為B型鞭毛菌株。

圖1 15株分離株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of the 15 strains in the 29 strains by PCR

圖2 14株分離株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplification of the 14 strains in the 29 strains by PCR

2.2 兩型菌株flic基因的PCR擴(kuò)增與鑒定結(jié)果以分離株P(guān)ASD01、PASD03基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出約1 100 bp和1 400 bp的片段，與預(yù)期目的片段（1 164 bp或 1 185 bp及 1 467 bp）相符（圖 3）。將PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體中進(jìn)行測(cè)序。

圖3 flic基因PCR擴(kuò)增擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 Amplification of flic gene by PCR

2.3flic基因的序列測(cè)定與分析 經(jīng)測(cè)序結(jié)果顯示，PASD01分離株flic基因?yàn)? 185 bp；PASD03分離株flic基因?yàn)?1 467 bp。應(yīng)用 DNAStar軟件中的MegAlign將所測(cè)flic基因序列與GenBank中參考株序列進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果顯示，PASD01分離株flic基因序列與A型flic基因序列同源性達(dá)99.6%～99.7%，PASD03分離株flic基因序列與B型flic基因序列同源性達(dá)98.9%～99.5%。而兩分離株之間的序列同源性為76%左右。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，PASD01分離株與A型親緣關(guān)系較近，PASD03分離株與B型菌株親緣關(guān)系非常相近，這與同源性分析結(jié)果一致（圖4）。

圖4 flic基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果Fig.4 Phyligenetic tree of flic gene from different species

本實(shí)驗(yàn)克隆得到水貂PA兩種鞭毛類(lèi)型的flic基因。這兩種類(lèi)型基因在同型H血清型菌株中高度保守，與GenBank中登錄的序列同源性均在98%以上，進(jìn)一步證明PASD01為A型鞭毛菌，PASD03為B型鞭毛菌。PA O抗原血清型眾多，但只有兩種H抗原血清型：A型和B型，這兩種鞭毛蛋白在基因水平上的差異為35%，各型PA表達(dá)a型鞭毛或b型鞭毛主要取決于抗原性和由flic基因編碼的鞭毛蛋白亞型的分子量大小[8-9]。Montie和Holder等證明用鞭毛制劑免疫小鼠將保護(hù)同源H血清型PA菌株攻擊的動(dòng)物，阻止PA從燒傷部位擴(kuò)散，其保護(hù)與攻擊菌株的O血清型無(wú)關(guān)，只要H血清型相同，使用同型的鞭毛疫苗免疫，均可以提供對(duì)PA感染的保護(hù)性[10-11]。本研究為進(jìn)一步研究flic基因表達(dá)功能性鞭毛蛋白及其應(yīng)用提供了重要依據(jù)，從而有利于PA新型防治方法和鞭毛亞單位疫苗的研制。

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