梅麗琴，曲云鵬，麻健豐，江明華

（1.溫州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院 兒童口腔科，浙江 溫州 325027；2.中國醫(yī)科大學遼陽中心醫(yī)院 口腔科，遼寧 遼陽 111000；3.溫州醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院 口腔修復科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325027）

霍亂毒素（cholera toxin，CT）是由霍亂弧菌分泌產(chǎn)生，引起霍亂腹瀉的主要作用物質(zhì)，由A、B兩個亞單位組成，A亞單位是整個毒素的活性中心；B亞單位（CTXB）沒有毒性，但它含有大部分毒素抗原的決定簇，有很強的抗原性和免疫原性，可以誘導機體產(chǎn)生較強的免疫反應，能與大多數(shù)哺乳動物細胞膜上的神經(jīng)節(jié)苷脂GMI結合，在霍亂的抗毒免疫中起重要作用[1-2]。國內(nèi)外研究證實CTXB是一種較為理想的免疫分子佐劑[3]?；蚍例x疫苗是近年的一個研究熱點，但現(xiàn)有的各種核酸防齲疫苗所誘導的免疫應答效能偏低，尚不能達到實用防齲的目的[4-5]。本實驗將霍亂毒素B亞單位編碼基因（ctxB）克隆到真核表達載體pVAX1，構建重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB，并進一步研究其在真核細胞中的蛋白表達情況，為CTXB在防齲核酸疫苗中應用前景做基礎性研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒及細胞株：大腸桿菌JM109購自華美生物工程公司；CHO細胞株購自中國科學院上海細胞研究所；重組質(zhì)粒p2355（含ctxB）及真核表達載體pVAX1獲贈于遵義醫(yī)學院劉建國教授。

1.1.2 主要試劑和儀器：限制性內(nèi)切酶EcoR I和Not I、DNA分子量Marker和T4DNA連接酶均購自大連寶生物公司；lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；膠回收試劑盒購自AxyPrep公司；DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；GoldViewTM核酸染料購自賽百盛公司；Plasmid Mini Kit I購自Omega公司；引物合成由上海生工生物技術公司完成。GM1為Sigma公司產(chǎn)品。羊抗CTBIgG抗體和CTB標準品為List biological laboratories，Inc.產(chǎn)品。辣根酶標記兔抗山羊IgG抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司產(chǎn)品。BSA為北京元亨圣馬生物技術研究所產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。酶標儀為上海三科儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒p2355中ctxB插入序列的測定：對含有ctxB的重組質(zhì)粒p2355進行測序，按Sanger雙脫氧鏈終止法進行。以重組質(zhì)粒p2355為DNA模板，分別以T7序列和載體近3’端序列：5’-atgatta aattaaaatttgg-3’為引物，通過一個測序反應測通。

1.2.2 引物設計合成：根據(jù)文獻報道的基因序列在National Bioscience Inc研制的分子生物學軟件oligo 6.0上設計合成并評價PCR引物。上游引物：5’-GCGGGTACCACCATGGATGACCGAAGCGACATCAAGC-3’；下游引物：5’-GGGAATTCTTAACTCTCAGCTGTCAAATAA TG-3’。在上游引物的5’端加入kozak啟動序列和EcoR I酶切位點，在上游引物的5’端加入Not I酶切位點。

1.2.3 擴增目的基因片段ctxB：以重組質(zhì)粒p2355為模板，按下列反應體系依次加樣：ddH2O 36.9μL 10×Exbuffer 5μL，dNTP mixture（各2.5 mmol/L）4μL，上游引物（10 pmol/μL）1μL，下游引物（10 pmol/μL）1μL，LA Taq酶0.1μL，p2355 1μL，總體積50μL。采用的循環(huán)條件為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 3 m 30 s，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min，4 ℃貯存。取5μL PCR擴增產(chǎn)物上樣1%瓊脂糖凝膠，1×TAE，60 V×1 h檢測擴增產(chǎn)物，于-20 ℃保存。

1.2.4 重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB的構建及酶切鑒定：PCR產(chǎn)物純化按照試劑盒操作說明書進行，用EcoR I和Not I對純化的PCR產(chǎn)物及少量提取的載體質(zhì)粒pVAX1進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳鑒定后回收，按照目的基因ctxB與載體pVAX1 4:1的摩爾比在T4DNA連接酶的作用下16 ℃過夜連接。取上述連接產(chǎn)物1μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM109，轉(zhuǎn)化后的JM109涂布于含100μg/mL卡那霉素的LB抗性篩選平板上。37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取單個菌落振蕩培養(yǎng)過夜并提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切進行鑒定后，以可以切出目的基因條帶的為陽性克隆，送至大連Takara生物技術公司測序，鑒定構建重組質(zhì)粒序列。

1.2.5 脂質(zhì)體介導pVAX1-ctxB瞬時轉(zhuǎn)染CHO細胞：取1.0×105/mL的CHO細胞，接種至6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL。24 h后，細胞匯合度達50%～80%時，進行細胞轉(zhuǎn)染：①分別取96μL無血清培養(yǎng)基至4個1.5 mL Eppendorf管中；②取Lipofectamine 2000 4μL分別加至上面的96μL培養(yǎng)基中，勿碰管壁；③室溫放置5 min；④加上述溶液到3個含1～2μg重組質(zhì)粒及1個作為對照的含1～2μg空質(zhì)粒的1.5 mL管中；輕輕混合，室溫溫育15～30 min；⑤沿孔周圍將上述溶液加至6孔板中的4個孔中，其余2孔作為CHO空細胞對照；⑥轉(zhuǎn)染細胞分別于24、48、72 h吸去培養(yǎng)基，冷PBS洗細胞2次。

1.2.6 GM1-ELISA法檢測CHO細胞蛋白表達產(chǎn)物：①用10μg/mL的GM1包被96孔微孔板，每孔100 μg，4 ℃過夜。②BSA封閉移去包被液，用含5% BSA的PBS2Tween20溶液37 ℃封閉2 h。③加入CHO細胞上清液：移去封閉液，加入3種不同濃度細胞上清液稀釋液（1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 μg/mL），同時設對照孔。每個濃度均設3個平行孔，每孔100μL，37 ℃作用2 h。④洗滌：移去液體，用PBS2Tween20溶液洗滌3次，每次3 min。⑤加入一抗：每孔加入1:4000稀釋的羊抗CTB IgG抗體100μL，室溫作用45 min。⑥洗滌：操作同④。⑦加入酶標二抗加入1:8000稀釋的辣根酶標記兔抗山羊IgG抗體，每孔100μL，室溫作用45 min。⑧洗滌：操作同④。⑨加入底物溶液：將底物OPD溶液加入96孔板，同時設空白對照孔。每孔100 μL，室溫避光作用15 min。⑩加入終止劑測定OD值：每孔加入50μL的2 mol/L H2SO4終止反應，立即測定492 nm的OD值。

2 結果

2.1 擴增目的基因片段ctxB 以重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB為DNA模板，擴增出約390 bp的目的基因片段；經(jīng)基因測序鑒定：該目的基因片段起始密碼ATG到最后1個密碼子，共有390 bp，與文獻中報道的ctxB基因?qū)獏^(qū)域的DNA序列和氨基酸序列完全一致（見圖1）。

圖1 ctxB PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 GM1-ELISA法檢測CHO細胞蛋白表達產(chǎn)物 采用SPSS 13.0分析軟件對GM1-ELISA實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，經(jīng)x2檢驗，P<0.05，證實重組質(zhì)粒pVAX1-ctxB蛋白表達產(chǎn)物可以與特異性抗體相結合，具有CTXB免疫源性。

3 討論

近年來CTXB作為佐劑已應用于某些細菌、病毒與寄生蟲等疫苗的研制中[6]。2000年何志勇等[7]將ctxB克隆到原核表達載體，并成功誘導重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達蛋白。選擇適宜的佐劑不僅能增強機體的免疫應答，更能作用于特定免疫細胞，從而選擇性地誘導形成針對特異性抗原的有效免疫應答[8-9]。有實驗結果顯示CTXB具有促進抗原遞呈細胞的抗原遞呈作用，并通過B細胞LgA型的轉(zhuǎn)換使機體LgA增加，誘導Th2細胞產(chǎn)生細胞因子（IL-4、IL-5）等功能，并促進淋巴細胞增殖和分化，分泌Th2型細胞因子，有效地誘導局部黏膜免疫以及全身免疫，從而輔助目的基因片段增加免疫效果[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，將CTXB克隆到真核表達質(zhì)粒pVAX1中，通過轉(zhuǎn)染重組質(zhì)?？梢栽谡婧思毎懈咝П磉_具有CTXB蛋白，可以用來加強防齲基因疫苗的免疫效價，為下一步構建多價防齲基因疫苗打下了基礎。

[1] Wang C, Luo J, Amer S, et al. Multivalent DNA vaccine induces protective immune responses and enhanced resistance against Cryptosporidium parvum infection[J]. Vaccine,2011,29(2):323-328.

[2] Pinkhasov J, Alvarez M , Pathangey LB,et al. Analysis of a cholera toxin B subunit (CTB) and human mucin 1 (MUC1)conjugate protein in a MUC1-tolerant mouse model[J]. Cancer Immunol Immun,2010,59(12):1801-1811.

[3] Liu C, Fan M , Bian Z, et al. Effects of targeted fusion anticaries DNA vaccine pGJA-P/VAX in rats with caries[J].Vaccine,2008,26(51):6685-6689.

[4] 孫梅芹,趙連三,王松,等.preS2S/adw真核表達質(zhì)粒構建及其表達的初步研究[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志,2003,11(1):3-5.

[5] 曲云鵬,劉建國,楊德琴.真核表達質(zhì)粒pVAX1的應用[J].溫州醫(yī)學院學報,2009,39(2):194-196.

[6] 楊亞波,孟曉麗,殷國榮,等. STAg和霍亂毒素滴鼻免疫小鼠誘導的鼻相關淋巴組織細胞免疫應答[J]. 熱帶醫(yī)學雜志,2006,6(11):1146-1149.

[7] 何志勇,李明峰,張惟杰,等. 霍亂毒素B亞單位基因(CtxB)的克隆及其表達[J].生物化學與生物物理學報, 2000,32(2):149-152.

[8] Wang C,Luo J, Amer S, et al.Multivalent DNA vaccine induces protective immune responses and enhanced resistance against Cryptosporidium parvum infection[J].Vaccine, 2011,29(2):323-328.

[9] Matsumoto Y,Suzuki S,Nozoye T, et al. Oral immunogenicity and protective efficacy in mice of transgenic rice plants producing a vaccine candidate antigen (As16) of Ascaris suum fused with cholera toxin B subunit[J]. Transgenic Res,2009,18(2):185-192.

[10] Flores J,DuPont HL,Paredes-Paredes M, et al. Pilot study of whole-blood gamma interferon response to the vibrio cholerae toxin B subunit and resistance to enterotoxigenic escherichia coli-associated diarrhea[J]. Clin Vaccine immunol,2010,17(5):879-881.