尉曉娜，謝于鵬，夏譽(yù)，何金彩

（溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 睡眠中心，浙江 溫州 325000）

低氧是特殊的單因素溫和暴露刺激，目前關(guān)于低氧對(duì)腦損害的研究主要體現(xiàn)在認(rèn)知功能方面，大量研究發(fā)現(xiàn)不同的低氧可以引起青年鼠空間參考記憶的損害[1-3]。但低氧對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為影響的研究甚少。有報(bào)道稱，在曠場(chǎng)活動(dòng)中，急性低氧可以引起新生鼠水平運(yùn)動(dòng)、垂直運(yùn)動(dòng)增加[4-5]，但是長(zhǎng)期低氧尤其是不同種類(lèi)的長(zhǎng)期低氧對(duì)小鼠曠場(chǎng)活動(dòng)的影響報(bào)道少見(jiàn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同時(shí)間低氧對(duì)成年小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為、體質(zhì)量的影響進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料設(shè)備 6月齡雄性C57BL/6J小鼠34只（購(gòu)自上海斯來(lái)克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司），體質(zhì)量23～28 g，清潔級(jí)動(dòng)物，按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類(lèi)動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。飼養(yǎng)條件：室溫（22±2）℃之間，濕度45%～55%。常壓低氧動(dòng)物飼養(yǎng)艙購(gòu)自長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司，壓縮高純度氮?dú)猓舛龋?9.99%）（溫州市申鹿氣體有限公司），曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)及視頻分析軟件（北京碩林苑科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案 按每天低氧時(shí)間不同隨機(jī)分成4組：低氧1組（8 h/d，n=9），低氧2組（12 h/d，n=8），低氧3組（24 h/d，n=9），正常氧濃度對(duì)照組（n=8）。低氧組小鼠在低氧艙中飼養(yǎng)8周后，檢測(cè)所有小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的行為變化并檢測(cè)其體質(zhì)量、心重指數(shù)變化。

1.3 模型的建立 所有低氧組小鼠暴露在常壓低氧動(dòng)物飼養(yǎng)艙內(nèi)以普通飼料、普通飲水飼養(yǎng)。氧艙內(nèi)條件：吸入O2濃度為8%～10%，CO2濃度低于1%，溫度為（22±2）℃，濕度為45%～55%。動(dòng)物自由攝食攝水，每周7 d，連續(xù)8周。每隔3～4 d花10 min左右清洗籠子。對(duì)照組小鼠在正常氧濃度條件下飼養(yǎng)，CO2濃度、溫度、濕度、飲用水、飼料與低氧組小鼠相同。

1.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[6]。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱是長(zhǎng)×寬×高為50 cm×50 cm×40 cm的黑色箱，底部畫(huà)有虛擬的16個(gè)小正方格，分成沿側(cè)壁的外周格（12個(gè)小方格），其余的中央格（4個(gè)小正方格），正上空有錄像檢測(cè)系統(tǒng)并與計(jì)算機(jī)分析軟件系統(tǒng)相連。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，操作者輕輕將小鼠放在正中央?yún)^(qū)，系統(tǒng)開(kāi)始同步自動(dòng)記錄小鼠5 min穿越每個(gè)格子的時(shí)間、路程。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用毛巾蘸取低濃度酒精擦拭箱底，等待其揮發(fā)消散避免留有氣味影響其他小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 心重指數(shù) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱每只小鼠的體質(zhì)量，處死小鼠，分離心臟，算出每只小鼠的心重指數(shù)（心臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析。多個(gè)樣本間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析法，兩兩比較方差齊者采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠穿越格子次數(shù)：見(jiàn)表1。與對(duì)照組比較，低氧1組小鼠總格數(shù)、中央格、外周格穿越次數(shù)均明顯增加，與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），低氧2組小鼠外周格、總格也明顯增加與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05），低氧3組增加不明顯。低氧1、2、3組增加幅度依次變小。

2.1.2 小鼠跨越不同區(qū)域的路程：見(jiàn)表2。與對(duì)照組比較，低氧1組小鼠總路程、中央路程、外周路程明顯增多，與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），低氧2組小鼠外周路程、總路程也明顯增多，與對(duì)照組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），低氧3組增加不明顯。低氧1、2、3組增加幅度依次變小。

表1 各組小鼠穿越格子次數(shù)比較（次±s）

表1 各組小鼠穿越格子次數(shù)比較（次±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低氧3組比：cP<0.05

低氧1低氧2低氧3對(duì)照9898 26.56±9.15bc 16.63±1.72 10.11±2.55 4.15±0.99 80.22±19.30bc 60.38±3.47b 39.89±7.88 16.88±4.77 106.78±28.41bc 77.00±4.69a 50.00±10.37 21.00±5.72

表2 各組小鼠跨越不同區(qū)域的路程比較（m±s）

表2 各組小鼠跨越不同區(qū)域的路程比較（m±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低氧3組比：cP<0.05

組別低氧1低氧2低氧3對(duì)照n9898中央1.45±0.52bc 0.96±0.16 0.51±0.17 0.14±0.08外周7.06±1.65bc 5.41±0.24a 3.66±0.63 1.60±0.41總路程8.51±2.16bc 6.37±0.28a 4.17±0.78 1.75±0.47

2.1.3 小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中各區(qū)域停留時(shí)間：見(jiàn)表3。低氧暴露后，各低氧組小鼠主要停留在外周區(qū)，低氧組與對(duì)照組比較在中央?yún)^(qū)、外周區(qū)停留時(shí)間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

表3 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中各區(qū)域停留時(shí)間比較（s±s）

表3 各組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中各區(qū)域停留時(shí)間比較（s±s）

組別低氧1低氧2低氧3對(duì)照n9898中央18229.78±3490.45 27027.63±9332.59 13885.00±5688.21 6015.88±2999.26外周274555.22±3526.31 267327.75±9300.20 280274.78±5567.06 289886.75±2977.39

2.2 低氧暴露對(duì)小鼠體質(zhì)量及心臟的影響 見(jiàn)表4。與對(duì)照組比較，各低氧組小鼠體質(zhì)量均減輕，低氧3組小鼠體質(zhì)量減輕最明顯且與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與對(duì)照組比較，低氧1、2、3組小鼠心重指數(shù)依次增大。

表4 低氧前后各組小鼠體質(zhì)量及心重指數(shù)變化（±s）

表4 低氧前后各組小鼠體質(zhì)量及心重指數(shù)變化（±s）

與對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低氧3組比：cP<0.01

組別低氧1低氧2低氧3對(duì)照n9898低氧前體質(zhì)量(g)24.56±0.50 24.38±0.63 24.78±0.68 25.63±0.68低氧8周體質(zhì)量(g)24.33±0.44bc 24.50±0.38ac 19.44±0.53bc 26.38±0.71c心重指數(shù)(×10-3)4.54±0.13c 4.64±0.13c 5.60±0.24b 4.28±0.16bc

3 討論

低氧后小鼠體質(zhì)量明顯下降，心重指數(shù)明顯增加，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；每日低氧時(shí)間越長(zhǎng)小鼠體質(zhì)量下降越明顯，心臟損害越嚴(yán)重，這說(shuō)明低氧模型建立成功。

低氧是種溫和刺激，與重復(fù)電刺激、強(qiáng)迫游泳[7]等不同，避免了因刺激本身產(chǎn)生的疼痛厭惡情緒對(duì)小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為的影響。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可用于測(cè)試動(dòng)物的活動(dòng)量、活躍程度、探索行為及對(duì)新空曠環(huán)境的認(rèn)知能力，還可測(cè)評(píng)焦慮情緒。小鼠對(duì)開(kāi)闊的新環(huán)境具有躲避傾向，這與小鼠先天喜歡在周邊區(qū)活動(dòng)的習(xí)性有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低氧后成年小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)變化。低氧后小鼠的外周格穿越次數(shù)、中央格穿越次數(shù)、總格穿越次數(shù)及相應(yīng)的路程均增加，說(shuō)明低氧可以引起小鼠活動(dòng)量的異常增加，這與以前研究結(jié)果[4，8]一致。小鼠活動(dòng)與腦結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[8]，低氧后小鼠活動(dòng)增加可能與低氧引起運(yùn)動(dòng)皮層結(jié)構(gòu)改變有關(guān)系[4]。另外小鼠在曠場(chǎng)內(nèi)的行為受活動(dòng)能力和情緒改變（動(dòng)機(jī)、焦慮和應(yīng)激）兩方面的影響[9-10]，很難確定到底是哪個(gè)因素引起的活動(dòng)能力改變，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。所有實(shí)驗(yàn)小鼠的外周區(qū)停留時(shí)間明顯長(zhǎng)于中央?yún)^(qū)停留時(shí)間，這與小鼠先天對(duì)空曠環(huán)境產(chǎn)生恐懼，喜歡沿壁活動(dòng)的習(xí)性有關(guān)，并且說(shuō)明低氧并不能改變小鼠的活動(dòng)習(xí)性。與對(duì)照組相比，低氧后小鼠中央?yún)^(qū)停留時(shí)間并無(wú)顯著延長(zhǎng)，說(shuō)明低氧對(duì)小鼠新環(huán)境認(rèn)知能力影響不是很明顯。

總之，低氧可以引起小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中活動(dòng)的增加及體質(zhì)量下降，隨著每日低氧時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠自發(fā)活動(dòng)異常增加的幅度反而下降，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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