張曉娟，李旭，欒正剛，馬曉春

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽 110001）

膿毒癥是指由感染引起的全身炎性反應(yīng)綜合征，其發(fā)生率以每年1.5%～8%的速度遞增［1］。高遷移率族蛋白 1（high mobility group box 1，HMGB1）是高遷移率族蛋白超家族成員之一，是廣泛存在于真核細胞核中最重要的非組蛋白，分子質(zhì)量小，含量豐富，序列高度保守［2，3］。HMGB1 是膿毒血癥晚期重要的炎性介質(zhì)［4］。血管內(nèi)皮細胞在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，當(dāng)其受到炎性刺激時可釋放HMGB1，促進細胞因子和黏附分子的表達［5，6］。HMGB1激活血管內(nèi)皮細胞的分子機制尚未明確。本研究旨在構(gòu)建HMGB1基因真核細胞表達載體，并鑒定重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細胞中后HMGB1蛋白的表達，為HMGB1基因在膿毒癥發(fā)病機制和細胞信號的研究提供有利的分子工具。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞和質(zhì)粒

人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞（human umbilical venular endothelial cell，HUVEC）株購自南京凱基生物公司，PCDNA-3.1-myc-his-B質(zhì)粒和大腸桿菌DH5α購自大連TaKaRa公司。

1.2 主要試劑

High-glucose DMEM、胎牛血清購于Hyclone公司；KpnⅠ、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶﹑T4 ligase DNA連接酶﹑氨芐青霉素100 mg/mL﹑瓊脂糖凝膠﹑DL2000 DNA Marker﹑HindⅢ-digest DNA Marker﹑RT-PCR 試劑盒均購自TaKaRa公司；Trizol購自Invitrogen公司；兔抗His標(biāo)簽抗體購自Santa Cruze公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自中杉公司，小提質(zhì)粒試劑盒、凝膠回收試劑盒購自于愛思進公司。引物合成、DNA測序鑒定由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建：用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)HUVEC至90%融合，Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴增HMGB1的可讀框。用Primer5.0軟件設(shè)計引物，上游和下游分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點，引物序列如下：上游：5′-GGGGTACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAGA-3′；下游 ：5′-CGGAATTCGTTTCATCATCATCATCTTCTTC-3′。擴增條件為：94 ℃ 2 min，94 ℃ 40 s，54 ℃ 40 s，72℃50 s，循環(huán)30次。擴增長度為647 bp，將PCR產(chǎn)物和PCDNA-3.1-myc-his-B用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳后切膠回收。T4連接酶16℃連接16 h，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，以含氨芐青霉素的LB選擇性固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，次日挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，然后測序。

1.2.2 提取無內(nèi)毒素重組載體：將酶切陽性且測序結(jié)果吻合的菌液接種于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，收集菌液，采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒，按照說明書抽提無內(nèi)毒素重組體。

1.2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：收獲處于對數(shù)生長期的HUVEC，以 5×104/孔接種于 6孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h，細胞長至80%～90%融合，按轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。將細胞分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染PCDNA-3.1-myc-his-B空載體）和實驗組（轉(zhuǎn)染PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒）。轉(zhuǎn)染48 h后收集RNA和蛋白進行相應(yīng)的檢測。

1.2.4 Western blot：PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，提取轉(zhuǎn)染后細胞的總蛋白，考馬斯亮蘭定量，將樣品調(diào)成相同的濃度，加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，沸水煮5 min，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，將膜與一抗（兔抗His標(biāo)簽抗體1︰500稀釋）4℃孵育過夜，PBST洗膜，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h，PBST洗膜，將膜與ECL發(fā)光底物結(jié)合，曝光，顯影。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖電泳結(jié)果

1%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示，PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小為647 bp，與GenBank中登錄的人HMGB1基因大小一致。見圖1。

2.2 PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒的的雙酶切鑒定

提取PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切，電泳結(jié)果如圖2所示，重組質(zhì)粒酶切后產(chǎn)生5 500 bp與647 bp 2個條帶，分別與PCDNA-3.1-myc-his-B和HMGB1基因大小相符，初步確定PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒測序結(jié)果分析

提取PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒，經(jīng)上海生工生物公司測序，結(jié)果與GenBank中HMGB1序列比對，完全一致，無移碼，無突變，確定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.4 蛋白水平檢測PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒在HUVEC中的表達

PCDNA-3.1-myc-his-B-HMGB1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，提取細胞總蛋白做Western blot檢測，與PCDNA-3.1-myc-his-B空載體轉(zhuǎn)染細胞組相比，外源重組蛋白HMGB1在PCDNA-3.1-myc-his-BHMGB1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組HUVEC內(nèi)有表達。見圖3。

3 討論

HMGB1是一種普遍存在的核蛋白，廣泛分布于哺乳動物細胞中，在胸腺、淋巴組織、睪丸和新生兒肝臟中均可檢測到高水平的HMGB1［7］。不同存在部位的HMGB1可發(fā)揮不同的生物學(xué)功能及效應(yīng)：細胞核內(nèi)的HMGB1為DNA結(jié)合蛋白，能維持核小體結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄及類固醇類激素受體的活性；胞外HMGB1為一種重要的炎性介質(zhì)和致炎細胞因子，是啟動和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，與膿毒癥的發(fā)病機理關(guān)系密切［8］。胞外HMGB1需要與相應(yīng)胞膜受體結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）與HMGB1具有高親和力，是HMGB1的主要受體［9］，HMGB1與RAGE結(jié)合后，可引發(fā)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）的磷酸化（包括 p38MAPK、JNK1/2、ERK1/2），核轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB 和活化蛋白 1的核內(nèi)轉(zhuǎn)移，使其他炎性因子如IL-1β、TNF-α及IL-8等表達加強，釋放增多，從而啟動炎癥或使炎癥惡化［10］。膿毒癥時，RAGE在內(nèi)皮中廣泛表達，提示HMGB1可能對血管內(nèi)皮細胞有激活作用，并且促成了對感染的炎性反應(yīng)。然而，RAGE不應(yīng)是HMGB1的唯一受體，近期研究結(jié)果顯示，Toll樣受體 2（toll like receptor 2，TLR2）和 4（TLR4）可能也作為HMGB1的受體參與HMGB1的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［11］。前期的研究證實，HMGB1可由激活的內(nèi)皮細胞釋放，促進細胞因子和黏附分子的表達增加。內(nèi)皮可能是HMGB1分泌的重要源泉［12］。本研究應(yīng)用PCR方法從HUVEC中擴增HMGB1全長基因，酶切后定向克隆到帶有HIS標(biāo)簽的真核細胞表達載體PcDNA3.1中，酶切測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建成功；再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HUVEC中，Western blot檢測到HMGB1在HUVEC中與轉(zhuǎn)染空載體組對比呈高表達。本研究結(jié)果為進一步探索HMGB1在膿毒癥血管內(nèi)皮細胞損傷或激活中的作用提供了一種新的研究工具。

［1］Angus DC，Linde-Zwirble WT，Lidicker J，et al.Epidemiology of severe sepsis in the United States：analysis of incidence，outcome，and associated costs of care ［J］.Crit Care Med，2001，29 （7）：1303-1310.

［2］Bustin M.Revised nomenclature for high mobility group（HMG）chromosomal proteins［J］.Trends Biochem Sci，2001，26（3）：152-153.

［3］Bianchi ME，Beltrame M.Upwardly mobile proteins.Workshop：the role of HMG proteins in chromatin structure，gene expression and neoplasia［J］.EMBO Rep，2000，1（2）：109-114.

［4］Wang H，Bloom O，Zhang M，et al.HMG-1 as a late mediator of endo toxin lethality in mice［J］.Science，1999，285（5425）：248-251.

［5］Ait-Oufella H，Maury E.The endothelium：physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis［J］.Intensive Care Med，2010，36（8）：1286-1298.

［6］Fiuza C，Bustin M，Talwar S，et al.Inflammation-promoting activity of HMGB1 on human microvascular endothelial cells［J］.Blood，2003，101（7）：2652-2660.

［7］Li J，Kokkola R，Tabibzadeh S，et al.Structural basis for the proinflammatory cytokine activity of high mobility group box 1 ［J］.Mol Med，2003，9（122）：37-45.

［8］Yang H，Wang H，Czura CJ，et al.The cytokine activity of HMGB1［J］.J Leukoc Biol，2005，78（1）：1-8.

［9］Kokkola R，Andersson A，Mullins G，et al.RAGE is the major receptor for the proinflammatory activity of HMGB1 in rodent macrophages［J］.Scand J Immunol，2005，61（1）：1-9.

［10］Chen G，Ward MF，Sama AE，et al.Extracellular HMGB1 as proinflammatory cytokine［J］.J Interferon Cytokine Res，2004，24（6）：329-333.

［11］Park JS，Svetkauskaite D，He Q，et al.Involvement of toll like receptors 2 and 4 in cellular activation by high mobility group box 1 protein［J］.J Biol Chem，2004，279（9）：7370-7377.

［12］Mullins GE，Sunden-Cullberg J，Treutiger CJ，et al.Activation of human umbilical vein endothelial cells leads to relocation and release of high-mobility group box chromosomal protein 1［J］.Scand J Immunology，2003，60（6）：566-573.