牛 熙，冉雪琴，王嘉福，2，陳 超

（1．貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025；2．貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)工程省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550025）

吡咯琳－5－羧酸合成酶（Pyrroline－5－Carboxylate Synthetase，P5CS）是谷氨酸合成脯氨酸過程中的關(guān)鍵酶。P5CS有催化谷氨酸磷酸化和將谷氨酸－γ－半醛還原成吡咯琳－5－羧酸（Pyrroline－5－Carboxylate，P5C）兩種酶活性。P5C再由吡咯琳－5－羧酸還原酶（Pyrroline－5－Carboxylate Reductase，P5CR）催化，生成脯氨酸［1］。脯氨酸是植物主要的滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)之一，干旱脅迫下P5CS基因的表達(dá)量上升，伴隨脯氨酸的合成增加［2］，脯氨酸量的積累與植物的抗旱能力直接相關(guān)［3－4］。干旱脅迫下，轉(zhuǎn)P5CS 基因冰草（Agropyron cristatum）中游離脯氨酸量增加，細(xì)胞質(zhì)膜的通透性、丙二醛生成量增幅減緩，超氧化物歧化酶活性增高，抗旱能力明顯提高［5］，轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum）、水稻（Oryza sativa）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）等植物中也發(fā)現(xiàn)類似的規(guī)律。高羊茅（Festuca arundinacea）是世界上重要的草坪草和牛羊等的優(yōu)質(zhì)飼草，抽穗期高羊茅中粗蛋白含量可超過11%［6］。黔草一號（Qiancao No．1，QC1）和黔草二號（Qiancao No．2，QC2）是貴州省草業(yè)研究所利用貴州野生高羊茅資源培育的高羊茅品種，兩個(gè)品種都有耐踐踏、易再生、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［7－8］。但這些培育的高羊茅品種P5CS 基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其與植株抗旱性的關(guān)系不甚明了。本研究主要分析人工培育的高羊茅品種P5CS基因結(jié)構(gòu)及其與抗旱性之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 高羊茅黔草一號（QC1）和黔草二號（QC2）均由貴州省草業(yè)研究所獨(dú)山實(shí)驗(yàn)基地提供，其中黔草二號分為黔草二號細(xì)葉（Qiancao No．2n，QC2n）和黔草二號寬葉（Qiancao No．2b，QC2b）。3份高羊茅材料均為生長2年的成熟植株，株高15～17cm，栽種于口徑30cm、高24 cm的塑料花盆內(nèi)。實(shí)驗(yàn)于2011年9月在貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，干旱處理前1d澆透水，澆水量達(dá)到花盆上部不再向下滲水為止。停止?jié)菜?5d后，植株萎蔫，分別剪取3份高羊茅材料的葉片，用于脯氨酸含量及P5CS酶活性的測定。同時(shí)將部分葉片凍存于－80℃，用于RNA的提取。每份高羊茅材料設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1．2 實(shí)驗(yàn)菌株 大腸桿菌（Escherichia coli TG1）為本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)藏菌株。

1．3 主要試劑 pMD18－T vector購自寶生物工程（大連）有限公司；Gel Extraction Kit購自 Omega公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit為 MBI Fermentas公司產(chǎn)品；DNA Marker和質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自天根生物科技（北京）有限公司。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，核苷酸序列的測定由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1．4 P5CS 基因的克隆

1．4．1 總RNA的提取 取1g葉片于液氮中研磨成粉，以酸酚－異硫氰酸胍－氯仿法提取總 RNA［9］，1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。

1．4．2 P5CS 基因的克隆 參照小麥（Triticum aestivum，NCBI nucleotide accession no．AY888045）P5CS基因序列，設(shè)計(jì)4對特異性引物P1：5′－ATGGCCGGCGCCGACCCCAA－3′，P2：5′－AAGGAAGGCTCTTATGGGTGTA－3′，mu：5′－AAGGCTCCATATGAGGATTCAT－3′，md：5′－AATCTGGACCAAGGCATCA－3′。引物P1與md組合，預(yù)擴(kuò)增片段1 267bp，得到P5CS基因的上半段；引物P2和mu組合，預(yù)擴(kuò)增片段1 657bp，得到P5CS基因的下半段。

取1μg總 RNA 按 RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，取1μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。目的片段經(jīng)1．0%瓊脂糖凝膠回收，與pMD18－T載體連接過夜，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌TG1，涂布于IPTG和X－gal的氨芐LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取白色單菌落，經(jīng)菌落PCR、質(zhì)粒PCR鑒定，選取陽性克隆子測定核苷酸序列。

1．4．3 P5CS基因的序列分析 應(yīng)用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析，通過NCBI的BLAST進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列相似性檢驗(yàn)，確定開放閱讀框（Open reading frame，ORF）；采用瑞士生物信息研究所的蛋白分析系統(tǒng)（Expasy Protein Analysis System）對目的基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，預(yù)測P5CS的理化性質(zhì)。以 MEGA 5．0軟件 Neighbor－Joining法分析系統(tǒng)進(jìn)化樹。系統(tǒng)樹采用重復(fù)1 000次的自展檢驗(yàn)（Bootstrap Analysis）。編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)經(jīng)SWISS MODEL（http：／／swissmodel．expasy．org／）在線分析。

1．5 P5CS酶活性及脯氨酸含量測定 取干旱處理后3份高羊茅材料的葉片各1g，參照文獻(xiàn)［10］提取蛋白并測定P5CS蛋白酶的活性。采用磺基水楊酸法［11］測定干旱處理后3份高羊茅材料葉片中的脯氨酸含量。

1．6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 12．0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 P5CS 基因的克隆 3份高羊茅材料總RNA經(jīng)甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測，25S、18S和5SrRNA三組條帶清晰（圖1），提取的總RNA質(zhì)量良好無降解，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 甲醛瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品總RNA的質(zhì)量Fig．1 Total RNA detection by 1%formaldehyde－agarose gel electrophoresis

分別以QC1、QC2n及QC2b總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，經(jīng)檢測，3份材料各獲得1 267和1 657 bp的兩種DNA片段，與預(yù)期大小相近（圖2）。

2．2 P5CS 基因的序列分析 分別將QC1、QC2n和QC2b的P5CS基因擴(kuò)增片段克隆到T載體中，測序得到1 267和1 657bp兩種DNA片段。兩種片段間有781bp的重疊，拼接后得到2 151bp序列。與已知序列相比，3份高羊茅材料的2 151bp序 列 與 朝 鮮 堿 茅 （Puccinellia chinampoensis，HQ637435．1）的P5CS基因序列相似性最高，均為

圖2 P5CS基因上半段（左）與下半段（右）的擴(kuò)增Fig．2 Amplification of P5CS gene fragments

注：M 為DL2000DNA Marker；泳道1～3分別為 QC1、QC2n及QC2bP5CS基因上半段；泳道4～6分別為QC1、QC2b及QC2nP5CS基因下半段。

Note：M，DL2000DNA Marker；Lane 1－3，5′－fragments of P5CSgene from samples QC1，QC2nand QC2b；Lane 4－6，3′－fragments of P5CSgene from samples QC1，QC2nand QC2b．94%，與擬南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻、大麥（Hordeum vulgare）P5CS基因的相似性為68%～91%，編碼氨基酸序列的相似性為71%～96%（表1），說明3份高羊茅材料的2 151bp序列的確為P 5CS基因。2 151bp堿基序列為完整的ORF，編碼716個(gè)氨基酸殘基。將QC1、QC2b和QC2n的P5CS基因核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對，3份高羊茅材料P5CS基因的核苷酸序列相似性為98%～99%，編碼氨基酸序列相似性均為99%。經(jīng)Expasy軟件分析，QC1的P5CS基因編碼蛋白的分子量為77．44kDa，等電點(diǎn)6．38；QC2n的P5CS基因編碼蛋白的分子量為77．40kDa，等電點(diǎn)6．19；QC2bP5CS 基因編碼蛋白的分子量77．30kDa，等電點(diǎn)5．96。

以人類P5CS氨基酸序列為外群，將3份高羊茅材料的P5CS氨基酸序列與NCBI基因數(shù)據(jù)庫收錄的100條P5CS氨基酸序列進(jìn)行聚類分析，從中選取有代表性的15個(gè)物種P5CS氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），QC1、QC2n、QC2b的P5CS與朝鮮堿茅相應(yīng)蛋白的親緣關(guān)系最近，與小麥、大麥及水稻、玉米（Zea mays）、高梁（Sorghum bicolor）、斑茅（Saccharum arundinaceum）及甘蔗（S．officinarum）聚為一類，而紫花苜蓿（Medicago sativa）、煙草、油菜（Brassica napus）及擬南芥聚為另一類。

將QC1、QC2n和QC2b的P5CS氨基酸序列與擬南芥等植物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，3份材料的P5CS蛋白均含有兩種酶活性的功能區(qū)，一種是谷氨酸激酶（Glu－5－Kinase，G5K），位于 P5CS蛋白的N端，另一種是谷氨酰半醛脫氫酶（Glutamyl 5－Phosphate Reductase，G5PR），位于P5CS蛋白的C端。其中G5K功能區(qū)包含ATP結(jié)合位點(diǎn)（ATP Binding Site）、亮氨酸結(jié)構(gòu)域（Conserved Leucine Domain）和谷氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（Glu－5－Kinase Domain，GK）。G5PR功能區(qū)包含NADPH結(jié)合位點(diǎn)（NADPH Binding Site）、預(yù)測的亮氨酸結(jié)構(gòu)域（Putative Leucine Domain）和氨酰半醛脫氫酶結(jié)構(gòu)域（GSA－DH Domain）（圖4）。

表1 3份高羊茅材料與已知P5CS基因比較Table 1 Comparison of P5CS genes between three tall fescues and the known plants %

圖3 以P5CS基因編碼氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（N－J法）Fig．3 Phylogenetic tree of P5CS amino acid sequence constructed by Neighbor－joining method with accession numbers

圖4 高羊茅P5CS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig．4 Diagram of conserved domains in P5CS protein of tall fescue

從QC1、QC2n和QC2bP5CS基因編碼的氨基酸序列中，找出6個(gè)氨基酸有差異（表2），主要位于P5CS的谷氨酸激酶（G5K）功能區(qū)，其中2個(gè)位于ATP結(jié)合位點(diǎn)的N端，另外4個(gè)散布于ATP結(jié)合位點(diǎn)和亮氨酸結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域。谷氨酰半醛脫氫酶（G5PR）功能區(qū)的氨基酸序列完全相同。以SWISS－MODEL在線預(yù)測 QC1、QC2n、QC2b和紫花苜蓿P5CS的谷氨酸激酶（G5K）功能區(qū)第13－281位氨基酸的三維結(jié)構(gòu)，3種蛋白的谷氨酸激酶（G5K）功能區(qū)均由9個(gè)α螺旋和13個(gè)β片層組成。3份高羊茅材料P5CS蛋白二級結(jié)構(gòu)的差異主要由于第37、85及142位氨基酸所帶電荷發(fā)生了變化（表3、圖5）。與QC1、QC2n、QC2b的P5CS蛋白三級結(jié)構(gòu)相比，紫花苜蓿P5CS蛋白也由9個(gè)α螺旋和13個(gè)β片層組成，有15個(gè)氨基酸所帶電荷發(fā)生了變化，二級和三級結(jié)構(gòu)的差異與P5CS蛋白一級結(jié)構(gòu)中氨基酸側(cè)基的帶電荷量有關(guān)。對比3份高羊茅材料及紫花苜蓿P5CS蛋白第68－175位區(qū)段氨基酸的帶電荷情況，紫花苜蓿帶電荷的氨基酸共28個(gè)，其中帶正電荷的氨基酸13個(gè)，帶負(fù)電荷的氨基酸15個(gè)，帶正電荷的氨基酸占帶電荷氨基酸的46．2%，QC1、QC2n、QC2b中帶正電荷的氨基酸所占比例分別為44．8%、41．4%和37．9%，紫花苜蓿P5CS帶正電荷氨基酸的比例最大，帶負(fù)電荷氨基酸所占百分比最小，QC2b的P5CS帶正電荷氨基酸所占百分比最小，帶負(fù)電荷氨基酸所占比例最大（表3）。

表2 QC1、QC2n和QC2bP5CS之間不同的氨基酸位點(diǎn)Table 2 Different amino acid sites in P5CS among QC1，QC2nand QC2b

表3 高羊茅與紫花苜蓿P5CS蛋白第68－175位氨基酸區(qū)段帶電荷氨基酸的數(shù)量比較Table 3 Comparison of charged amino acid amounts from amino acid 68to 175of P5CS between tall fescues and alfalfa

圖5 高羊茅P5CS谷氨酸激酶（G5K）結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)比較Fig．5 Comparison of deduced three－dimensional structure of G5Kdomain in P5CS protein of three tall fescues

2．3 P5CS酶活性及脯氨酸含量的測定 取干旱處理后3份高羊茅材料的葉片，分別測定P5CS酶活性及其脯氨酸含量（圖6）。結(jié)果表明，QC1葉片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最高（P＜0．01），QC2b的P5CS酶活性及其脯氨酸含量最低（P＜0．01），QC2n的居中。

3 討論

本研究以QC1、QC2n、QC2b為3份實(shí)驗(yàn)材料，采用RT－PCR方法分別擴(kuò)增出P5CS基因。與已知序列相比，3個(gè)P5CS基因編碼的蛋白中均含有谷氨酸激酶功能區(qū)和谷氨酰半醛脫氫酶功能區(qū)，這兩個(gè)功能區(qū)是高等植物P5CS蛋白的共有結(jié)構(gòu)。說明本研究克隆到的基因的確為P5CS基因并且結(jié)構(gòu)完整。

圖6 QC1、QC2n、QC2b葉片的P5CS酶活性及其脯氨酸含量Fig．6 Activities of P5CS enzymes and contents of proline in leaves from tall fescues QC1，QC2nand QC2b

P5CS是谷氨酸合成脯氨酸的關(guān)鍵酶，酶活性的高低直接影響植物脯氨酸的生成量。脯氨酸有助于提高植物的抗逆性［12－13］。對豇豆（Vigna unguiculata）P5CS基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使第129位氨基酸從苯丙氨酸（Phenylanlanine，Phe）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine，Ala），則P5CS的酶活性和脯氨酸合成量上升［4］。對比3份高羊茅材料的P5CS氨基酸序列，在谷氨酸激酶（G5K）功能區(qū)有6個(gè)氨基酸不同，其中第37、85及142位氨基酸位于P5CS的第68－175位氨基酸區(qū)段，處于ATP結(jié)合位點(diǎn)和亮氨酸結(jié)構(gòu)域的中間區(qū)域，位于P5CS完整蛋白的外表面。ATP結(jié)合位點(diǎn)主要結(jié)合ATP，亮氨酸結(jié)構(gòu)域通過拉鏈結(jié)構(gòu)將P5CS兩個(gè)功能區(qū)相接，以維持P5CS蛋白三級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定［14］。3份高羊茅材料P5CS蛋白第37、85及142位氨基酸的變異導(dǎo)致這些位點(diǎn)所帶電荷發(fā)生了變化，3個(gè)變異位點(diǎn)正處于亮氨酸結(jié)構(gòu)域的周圍，可能因此影響蛋白的三級結(jié)構(gòu)，影響蛋白的酶活性。研究證實(shí)，紫花苜蓿的抗逆性強(qiáng)于高羊茅，脯氨酸含量也高于高羊茅［15］。對比3份高羊茅材料QC1、QC2n、QC2b與紫花苜蓿P5CS蛋白的第68－175位氨基酸中帶電荷極性氨基酸的數(shù)量，紫花苜蓿帶正電荷的氨基酸百分比明顯高于本研究中的3份高羊茅材料。結(jié)合3份高羊茅材料P5CS酶活性及脯氨酸含量的測定結(jié)果，以及3份高羊茅材料中QC1的抗旱性最強(qiáng)等研究［16］，推測第68－175位氨基酸區(qū)段正電荷氨基酸的數(shù)量增加可能提高P5CS的酶活性，增加脯氨酸的合成量，增強(qiáng)植物的抗旱能力；正電荷量下降／負(fù)電荷量增加則可能降低P5CS的酶活性，減少脯氨酸的合成量，抗旱能力也隨之下降。另外從葉型上看，高羊茅QC1的葉片最窄，QC2n其次，QC2b的葉片最寬。較窄的葉片散熱慢，蒸騰失水少［17］，可能也是3份高羊茅抗旱性差異的原因之一。這些研究結(jié)果可為轉(zhuǎn)基因高羊茅植株的定向突變提供理論依據(jù)，也有助于培育抗逆性更強(qiáng)的高羊茅品種和植物抗逆機(jī)理等研究。

致謝：感謝貴州省草業(yè)研究所莫本田研究員提供的幫助。

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