楊秀松，張新平

（1. 國家食品藥品監(jiān)督管理局高級研修學院，北京 100073；2. 上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 201101）

枯草芽孢桿菌產果膠裂解酶培養(yǎng)基優(yōu)化研究

楊秀松1，張新平2

（1. 國家食品藥品監(jiān)督管理局高級研修學院，北京 100073；2. 上海交通大學農業(yè)與生物學院，上海 201101）

通過 Plackett-Burman試驗設計，從葡萄糖、果糖、豆粕粉、氯化銨、乙酸銨、硫酸銨、蛋白胨、酵母提取物、K2PHO4、KH2PO4、CaCl2等11個相關因子中篩選出對枯草芽孢桿菌產果膠裂解具有顯著影響的因子——果糖、豆粕和酵母提取物，選取因子豆粕和酵母提取物進行響應面設計分析，研究結果表明當豆粕和酵母提取物含量分別為100 g/L, 25 g/L時，果膠裂解酶活性最大為22.69 U/mL。

枯草芽孢桿菌；果膠裂解酶；中心組合設計

0 引言

果膠酶（pectolytic enzyme or pectinase）是分解果膠物質的多種酶的總稱，果膠裂解酶是以反式消去作用斷開果膠聚合物主鏈為特征，是果膠酶的重要組成部分[1]，廣泛存在于細菌、真菌和放線菌等微生物。近年來果膠裂解酶在棉紡織品的生物精練、食品工業(yè)特別是果汁果酒的澄清和提高果汁出汁率等方面發(fā)揮著重要的作用[2]。目前，國內對于果膠酶的研究多數(shù)是以復合酶的形式進行，對于每種酶的具體作用其實并不清楚，有些果膠酶組分可能對于其具有抑制作用，因此，使用果膠酶單一組分具有大幅度提高果膠酶應用的價值[3]，因而開展對于果膠酶單一組分的應用研究顯得尤為必要。

酶的生產成本是決定酶能否廣泛使用的關鍵因素，因而采用發(fā)酵工程技術提高酶的產量和降低生產成本是實現(xiàn)酶大量和廣泛應用的基礎。Plackett-Burman試驗設計是一種經濟有效的兩水平試驗設計方法，該法主因素為正交設計，兩因素間的交互作用僅部分與主因素產生交錯作用。此設計方法雖然不能考察各因子之間的交互作用，但可以利用最少的試驗次數(shù)，從眾多的考察因素中快速而有效地篩選出主要的影響因子。與傳統(tǒng)的優(yōu)化方法相比，中心組合試驗設計方法所需的試驗組數(shù)相對較少，可節(jié)省人力物力，已經被成功地用于各種過程的優(yōu)化分析中。本研究依次使用Plackett-Burman篩選試驗設計和中心組合試驗設計，對果膠裂解酶產生菌枯草芽孢桿菌，在搖瓶規(guī)模的發(fā)酵產果膠裂解酶的培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化[5-6]，為大規(guī)模生產果膠裂解酶提供技術參考。

1 材料和方法

1.1 材料

枯草芽孢桿菌：某大學食品微生物試驗室提供。豆粕粉：市場購買。咔唑：北京化學試劑公司。其他試劑均來自國藥集團。

1.2 儀器與設備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司。752紫外光柵分光光度計：上海第三分析儀器廠。GZX-GFC-101-3-S電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博泰試驗設備有限公司。滅菌鍋：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。BJ-CD超凈工作臺（NEW TYPE CLEAN BENCH SERIES）：BOXUN CORP。精密電子天平：賽多利斯（SARTORIUS）科學儀器（北京）有限公司。移液槍：PHYSIOCARE, CONCEPT。飛鴿牌離心機：上海安亭科學儀器廠。THZ-C/TCYQ 恒溫振蕩器（搖床）：江蘇太倉試驗設備廠。UPH-40自動純水系統(tǒng)：優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基制備

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2，蛋白胨0.4，酵母提取物0.2，瓊脂2.0，水100 mL。種子培養(yǎng)基：葡萄糖2，酵母提取物0.4，酵母提取物0.2，水100 mL。

1.3.2 枯草芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)

取一環(huán)枯草芽孢桿菌接種到斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)18 h，然后于4 ℃冰箱保存待用。將斜面上的細菌接種到高溫滅菌后的種子培養(yǎng)基中，于37 ℃、140 r/min條件下，恒溫培養(yǎng)24 h，然后分別接種到表2和表4的按編號配置好的培養(yǎng)基中，37 ℃，140 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.3 咔唑-乙醇溶液的配制

將0.15 g咔唑溶解于50 mL無水乙醇中，轉移到100 mL的容量瓶中，用無水乙醇定容至100 mL。

1.3.4 果膠裂解酶酶活的測定

取上述培養(yǎng)結束的發(fā)酵液10 mL，在6 000 r/min下離心10 min，于4 ℃保存，分別加入聚半乳糖醛酸進行酶促反應。以聚半乳糖醛酸為底物，在235 nm處測定反應混合物的吸光值。一個標準酶活單位（IU）定義為：每分鐘時間使聚半乳糖醛酸裂解產生1 μmol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。不飽和聚半乳糖醛酸在235 nm處的摩爾吸光系數(shù)為4 600 L? mol-1? cm-1。

1.3.5 培養(yǎng)基優(yōu)化試驗方案

本研究對11個因子（葡萄糖，葡萄糖，果糖，氯化銨，乙酸銨，硫酸銨，蛋白胨，酵母提取物，K2HPO4，KH2PO4，CaCl2）進行了析因設計，得出了20組培養(yǎng)基組合并進行了枯草芽孢桿菌產果膠裂解酶試驗，結果見表1和表2。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素水平及編碼Tab. 1 Factors and codes for Plackett-Burman design

表2 篩選試驗表Tab. 2 Design for factor screening experiment

在Plackett-Burman篩選試驗設計的基礎之上，本研究采用中心組合試驗設計方法對影響果膠裂解酶生產過程中的關鍵因子水平及其交互作用進行了優(yōu)化與評價。利用JMP軟件對初選出的關鍵因子（豆粕、酵母提取物）進行設計和編碼，得出了10組培養(yǎng)基配方（見表3、表4）。

表3 中心復核設計試驗因素水平及編碼Tab. 3 Factors and codes for central composite design

表4 中心復合設計試驗表Tab. 4 Experiments for central composite design

取已經培養(yǎng)好的種子液20 mL，加入到按編號配置好的培養(yǎng)基中，在37 ℃、140 r/min條件下恒溫培養(yǎng)24 h，制備粗酶液。

2 結果與討論

2.1 不同因子對果膠裂解酶活影響的顯著性評價

用Plackett-Berman法確定對產果膠裂解酶具有顯著性影響的因子，試驗結果如表2。由表2可知，在20組試驗中，果膠裂解酶的活性大小由0.15 U/mL到19.07 U/mL，說明培養(yǎng)基的組成成分對微生物的產酶能力有顯著的影響。因此，必須對培養(yǎng)基的組分進行優(yōu)化以得到最大的產酶培養(yǎng)基。用Plackett-Berman篩選顯著影響因子，只能考慮到多個影響因子里的主效應的影響，而無法考慮到因子之間相互作用的影響。由表5可知，對微生物產果膠裂解酶能力具有正向影響作用即促進產酶的因子是果糖（X2）、豆粕粉（X8）和酵母提取物（X5），對產酶能力具有負向即抑制產酶的因子是葡萄糖（X1）。果糖的市場價格高，考慮到成本和產酶條件的穩(wěn)定性，舍去果糖。選擇豆粕和酵母提取物進行響應面設計，進一步優(yōu)化產酶培養(yǎng)基的組成。

表5 篩選試驗排序參數(shù)估計值Tab. 5 Estimated values of factors for screening experiment

2.2 響應面設計培養(yǎng)基的優(yōu)化

利用響應面設計中的中心復合設計，得到有兩個中心點的響應面設計，該設計共有10組試驗，如表4所示。由表4可知，果膠裂解酶活性在不同培養(yǎng)條件下酶活由1.24 U/mL增加到22.69 U/mL，酶活顯著增加。利用軟件對模型進行分析，得到實測值與預測值之間的差異圖，見圖1。由圖1可知，實測值與預測值的誤差在5 %內，R2= 0.92，說明模型預測值與實際值的線性關系良好；對模型進行方差分析，由p ＜ 0.05可知，模型中的各個因子對模型的影響顯著。表6列出了各個因子對模型影響顯著性的差異，由表6的p值可以看出，豆粕對模型的影響最顯著。通過因子刻畫器可以看出各個因子對試驗模型影響的趨勢，結果如圖2所示。

圖1 實際值對預測值圖Fig. 1 Values of detection and prediction

表6 響應面設計排序參數(shù)估計值Tab. 6 Estimated values of factors for central composite design

由圖2可知，各個因子對模型的影響顯著性各不相同，豆粕對模型的影響呈正向曲線關系，說明當豆粕濃度達到一定量時，酶液中的果膠裂解酶活性達到最大；由表6和圖2可知，酵母提取物對果膠裂解酶活性的影響不顯著，與篩選試驗得到的結果相矛盾，這是因為篩選試驗只考慮到主效應的影響，忽略了各個因子之間的交互作用，在試驗過程中引起了誤差。

圖2 預刻畫器圖Fig. 2 Prediction profiler

預測刻畫器給出了各個因子單獨存在時對模型的影響，通過交互因子刻畫器可以看出各個因子的相互作用對試驗模型的影響，結果如圖3。

圖3 交互作用刻畫器圖Fig. 3 Prediction profiler for interaction

由圖3可知豆粕和酵母提取物之間兩條線不相交，說明豆粕和酵母提取物之間不存在交互作用。響應曲面是各個因子的立體曲面圖，通過響應曲面更為直觀地顯示出不同酶活下各個因子的比例及用量，如圖4所示。

圖4 酵母提取物和豆粕對果膠裂解酶活性影響的響應曲面圖Fig. 4 Effect of yeast extract and soybean meal on pectinases activity

在響應曲面上畫等高線，得到等高曲線圖圖5，在等高曲線圖上可以清晰地看出在酶活一定的情況下豆粕和酵母提取物的不同比例，便于得到最佳比例。

圖5 響應曲面等高曲線圖Fig.5 Contour chart of rotational orthogonal experimental design

通過預測刻畫器、相互作用刻畫器、曲面圖、等高線等分析得到，微生物產酶量與各種因子之間的方程為Y = 0.8A2+1.14B2+ 0.071AB ? 3.763B ? 8.07A + 27.23。

式中：Y-為菌株產果膠裂解酶的預測值；A和B分別為上述2個自變量的編碼值。

對方程變量求導即可得到Y最大值時各個因變量的數(shù)值，也可通過軟件自帶的最大化意愿得到各個因子的最佳數(shù)值，結果如圖6。由圖6物濃度為2.5 g/100mL時，培養(yǎng)基酶活達到最大值22.69 U/mL。

圖6 最大化意愿預測刻畫器圖Fig. 6 Prediction profiler for maximize desirability

3 結論

眾所周知，培養(yǎng)基組分影響著微生物的生物量的變化和代謝產物的合成與分泌，研究培養(yǎng)基組分對于提高微生物的生物學特性具有重要的意義。本研究通過對枯草芽孢桿菌生產果膠裂解酶對于碳源、氮源以及礦質元素等影響因素效應的統(tǒng)計學分析，從葡萄糖、果糖、豆粕粉、氯化銨、乙酸銨、硫酸銨、蛋白胨、酵母提取物、K2PH04、KH2PO4、CaCl2等11個相關因子中篩選出對枯草芽孢桿菌產果膠裂解具有顯著影響的因子——果糖、豆粕和酵母提取物，并進一步通過中心組合設計研究豆粕和酵母提取物的響應效應，在豆粕和酵母提取物含量分別為100 g/L, 25 g/L時，果膠裂解酶活性達到最大值22.69 U/mL。

[1] 趙政, 董云舟, 堵國成, 等. 堿性果膠裂解酶搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 工業(yè)微生物, 2003, 32(2): 9-14.

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[5] PAN H F, XIE Z P, BAO W N, et al. Optimization of culture conditions to enhance cis-epoxysuccinate hydrolase production in Escherichia coli by response surface methodology[J]. Biochem. Eng., 2008, 42(2): 133-138.

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Optimization of Culture Components for Pectinase Production
by Bacillus Subtilis

YANG Xiu-song1, ZHANG Xin-ping2
( 1. State Food and Drug Administration Institute of Executive Development, Beijing 100073, P. R. China；2. School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 201101, P. R. China )

A Plackett-Burman design was used to screen the significant factors from glucose, sucrose, soybean meal, NH4Cl, (NH4)2CHCOOH, (NH4) SO4, peptone, yeast extracts, K2PHO4, KH2PO4and CaCl2to affect pectinase production. Furthermore, central composite design of experiments was carried out to optimize the optimal levels of two important factor, namely soybean meal and yeast extracts. The optimum concentration levels for obtaining maximum 22.69 U/mL pectinase activity were: 100 g/L soybean meal and 25 g/L yeast extracts.

Bacillus Subtilis; pectinase; central composite design

Q815/TQ92

A

1001-4543(2012)02-0105-07

2012-04-09;

2012-05-17

楊秀松（1975－），男，北京人，工程師，碩士，主要研究方向為食品安全檢測，電子郵箱yxs@sfdaied.org。