張珠明，汪仁莉，趙德明

（1.寧夏大學農學院動物科學系，寧夏 銀川750021；2.中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 國家動物海綿狀腦病實驗室，北京 海淀100193）

世界衛(wèi)生組織曾預言，到2040年，最常見的致死性疾病中，神經退行性疾病將會攀升至第二位，僅次于癌癥。在這類疾病中，朊病毒病是惟一能通過動物模型直接探尋體內病理學機理的一種。朊病毒病是由朊病毒引起人和動物出現(xiàn)以中樞神經系統(tǒng)退行性病變?yōu)樘卣鞯囊活惣膊?，主要包括人的庫魯病、克雅氏病、致死性家族性失眠，牛的海綿狀腦病、綿羊和山羊的癢病、鹿科動物的慢性消耗性疾病等等。目前認為該類疾病的病原朊病毒是一種不含核酸的蛋白顆粒，是機體內正常朊蛋白PrPC發(fā)生構象轉化錯誤折疊形成的異常朊蛋白PrPSc。朊病毒在形態(tài)上是一種蛋白聚集物，感染機體后，不能被體內的蛋白酶消化清除，也不會引起機體的免疫反應和炎癥反應，因此不易早期發(fā)現(xiàn)和進行治療。多年來，研究朊病毒病的科學家們一直致力于該病的發(fā)病機制和治療方面的研究，希望通過體外或體內試驗找出抑制朊病毒轉化、增殖或轉移的方法，但仍然沒有一種藥物足夠有效地預防和治療這類疾病。朊病毒在機體內復制的分子基礎是PrPC與PrPSc間構象轉化，故而阻斷PrPC向著PrPSc轉化是朊病毒病治療的一個切入點。此外，朊病毒病主要特征是朊病毒在中樞神經系統(tǒng)聚集，引起患病個體腦組織的病理變化，因此，減少PrPSc的蓄積也是治療過程中經常考慮到的另外一個方面。故而，用于治療的藥物如果能夠突破血腦屏障（brain－blood barrier，BBB）進入中樞神經系統(tǒng)（centre nerves system，CNS），或者直接將藥物引入到腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）或腦組織，從這兩個方面入手都有可能起到延緩疾病發(fā)生的作用。目前為止，在朊病毒病的治療方面取得的進展主要有以下幾點。

1 化學治療

化學治療常常使用一些具有抗朊病毒作用的化合物，包括聚陰離子化合物硫酸肝素、粘多糖以及粘多糖類似物剛果紅、四環(huán)類化合物（如四環(huán)素，強力霉素）、多烯類抗生素（如兩性霉素B）、阻斷β－折疊形成的多肽類（如小鼠或倉鼠的朊蛋白多肽PrP119－136）等［1］。環(huán)己二胺四乙酸二鈣鈉能通過螯合感染 M1000的Balb／c小鼠腦內的 Mn2＋進而減少PrPSc的含量［2］。羥乙基哌嗪乙硫磺酸的體外試驗中，對感染朊病毒的細胞有明顯地抑制PrPSc的蓄積作用，而且這種抑制有濃度依賴性［3］。

這些抗朊病毒的化合物在體外選擇性地與PrPC或PrPSc靶向結合，或靶向作用于PrPC→PrPSc的轉化過程，阻止PrPC轉化成PrPSc，從而抑制了朊病毒的增殖。然而，這些物質在體外培養(yǎng)接種朊病毒的細胞模型中有效，有的且對動物模型有毒性，或在體內治療效率極低，甚至無效［4］。

2 LRP／LR受體特異性抗體治療

至今發(fā)現(xiàn)的朊蛋白細胞表面受體有很多種，近年來，朊蛋白37－kDa／67－kDa層粘連蛋白受體及其前體（LRP／LR）備受關注，體外證明該受體是朊病毒分子PrPSc在細胞內復制和聚集所必需的蛋白。因此，在理論上利用LRP／LR的特異性抗體與LRP／LR蛋白特異性結合可以抑制或者阻斷PrPSc在細胞內的聚集。體外試驗已證明Anti－LRP／LR抗體W3可以抑制PrPSc在感染癢病病毒的神經細胞ScN2a內的聚集［5］；在體內試驗中，將 LRP／LR的重組單鏈抗體片段（single chain antibodies，scFV）注射免疫C57BL／6小鼠后，降低了PrPSc在外周組織內的增殖，且明顯延長了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期［6］。利用基因工程的方法，將表達LRP／LR抗體scFV的基因克隆到改造的腺病毒（adeno－associated virus，AAV）基因內，然后將組裝成的AAV擴增子經腦內注射到C57BL／6小鼠的海馬，使LRP／LR的抗體scFV基因在體內得到表達。產生的LRP／LR抗體scFV與層粘連蛋白的特異性結合能夠抑制PrPSc在小鼠外周組織細胞內的復制和增殖，延長了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，而且在該小鼠脾臟內也檢測到了AAV基因［7］。這表明朊蛋白特異性受體LRP／LR抗體的應用可以作為朊病毒病治療的一種手段。此外，以腺病毒基因作為載體運載的表達LRP／LR的抗體scFV的基因能夠在機體各組織中分布，且能產生有效的主動免疫抗體，也可以作為朊病毒病的一種潛在治療方法。

3 RNA干擾

RNA干擾是翻譯后修飾水平上沉默內源性基因最有力的技術。在幾種神經退行性疾病的動物模型中已經表現(xiàn)出治療的潛力。慢病毒介導的抗PrP的shRNA的表達有效地抑制了朊病毒的復制延長了癢病感染小鼠的存活時間［8］。慢病毒載體介導的LRP／LR基因特異的干擾siRNA腦內注射癢病毒株RML感染的LC57BL／6小鼠后，也能夠延長小鼠的臨床發(fā)病潛伏期［9］。RNA干擾已成為神經類疾病極有效的治療方法。

4 免疫治療

朊病毒不能引起機體內產生主動免疫抗血清，因此不能夠利用疫苗來治療。最早提出的朊病毒病抗體治療方法是基于1988年的一項體外研究：體外感染癢病病毒的細胞與抗PrP抗體孵育一段時間后降低了該細胞的傳染性［10］。已有研究發(fā)現(xiàn)，PrP抗體在體外培養(yǎng)的細胞模型和動物模型體內都可以降低朊病毒的感染性。PrP抗體以及重組的抗原結合片段（antigen－binding fragment，F(xiàn)ab）可以抑制朊病毒在ScN2a細胞內的復制和增殖。抗PrP中間片段的抗體（PrP90－110，132－156）不僅可以有效抑制癢病病毒感染細胞，還能降低感染鼠脾臟內的PrPSc［11］。RML朊病毒株感染的小鼠如果在早期就應用單克隆抗體ICSM35（PrP143－153）和ICSM18（PrP93－105）進行干預，能夠減弱發(fā)病狀況，并且沒有副作用［12］。

抗體治療方法已經成為朊病毒病治療研究的一個挑戰(zhàn)。大量體外試驗研究已經證明，PrP抗體具有抗朊病毒效果，但是在動物體內進行應用時，還要考慮抗體分子大小、抗體給予途徑、抗體在機體內的擴散性等因素。

4.1 不同類型的抗體 在動物模型體內，直接注射抗PrP全長的抗體分子可以降低朊病毒感染性，但是由于全長抗體IgG分子量很大，不易穿過血管進入組織，尤其難以穿過BBB，進入腦組織。此外，機體內存在復雜的生物級聯(lián)反應對抗體的應用也造成了一定的困擾，例如，研究發(fā)現(xiàn)腦內注射抗PrP的IgG抗體之后，IgG與PrPC的交聯(lián)作用在體內造成了海馬神經元和小腦神經元的死亡［13］。而且由于全長抗體在機體內擴散性能較差，如果用以治療朊病毒病，只有在外周感染的同時或感染之后立即注射抗體，才能夠阻止朊病毒從外周組織轉移到CNS，在一定程度上抑制其致病性?；谌L抗體分子較大，有人又研究出了單價小分子抗體片段Fab，但是Fab也不易穿過BBB。因此，全長的抗體和Fab都不宜直接注射到動物體內，以產生被動免疫來預防和治療朊病毒病。另外還有一種可變區(qū)的scFV，這是一種單價小抗體，只含抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，兩個可變區(qū)之間由一段融合多肽連接。這種抗體保留了抗原結合特異性，且應用基因工程的手段能夠使scFV在細胞內表達并被分泌到細胞外。Campana等人分別利用重組的病毒基因載體AAV和慢病毒將重組的朊蛋白抗體D18scFV轉染到ScN2a細胞和scGT1細胞內，結果AAV－D18scFV和慢病毒－D18scFV都降低了細胞內PrPSc的量［14］。

4.2 抗體在機體內的擴散性 動物機體通過直接注射的抗體能夠獲得被動免疫，該類抗體在機體內的擴散性不好，通常難以穿過血管進入到機體各組織，尤其難以進入CNS。因而，抗體能夠在機體內擴散是抗體治療朊病毒病的關鍵條件。全長抗體和Fab在體內的擴散性不好，而病毒基因載體運輸scFV的方法能夠產生較好的擴散性，如改造的AAV、HSV或lentivirus可以攜帶scFV抗體基因在機體組織內擴散，并能夠穿過BBB。與IgG和Fab相比，scFV抗體具有更廣泛的應用價值。Wuertzer等人利用重組的AAV2作為病毒載體運輸D18scFV抗體到朊病易感小鼠的CNS內，同時外周接種感染朊病毒，明顯延遲了小鼠的臨床發(fā)病潛伏期，且免疫組化和Western blot結果顯示CNS內PrPSc的量降低［15］。值得注意的是，應用病毒載體使朊病毒抗體進入到腦組織內的方法并不可能完全阻止朊病毒感染，因為傳染性朊病毒的復制主要發(fā)生在外周淋巴組織內，PrPSc仍然能夠在外周組織內復制，并可能通過神經入侵的方式從外周組織轉移到CNS。由于PrPC→PrPSc的蛋白結構轉化過程還未完全弄清楚，對于抗體治療方法，要找到確切的、能夠特異性阻斷朊病毒增殖的抗體，并且要使抗體能夠在機體組織內擴散，穿過BBB在CNS內擴散，還需要大量的科學試驗來不斷研究和探索。

4.3 抗體的被動免疫和主動免疫 直接給動物注射抗體用以治療朊病毒病時，要生產大量的單抗，而生產單抗對生物學技術的要求較高，且需要大量的經費。因此，為了研究出一種真正具有可行性的治療方法，科學家們結合被動免疫和主動免疫，研究出了一種由病毒基因載體運載的靶向結合PrP抗體的治療方法，該方法中將朊病特異抗體的單價小抗體分子scFV基因克隆到病毒載體如AAV、慢病毒或單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV），然后經病毒包被將組裝成的病毒擴增子注射到動物體內，使scFV抗體在動物機體內長期表達，并保持其免疫特異性。這種方法產生的scFV特異抗體能夠被分泌到細胞外，且能從注射部位擴散到機體其他部位，并穿過BBB在CNS內擴散，達到了主動免疫治療目的，克服了前面提到的被動免疫擴散性差的弊端。此外，病毒基因作為載體運輸抗體基因已成為一種有前景的治療手段，用于治療多種神經退行性疾病，如利用HSV基因載體治療帕金森病。

綜上所述，科學家已經在朊病毒病治療方面的研究上做了很多努力，這些發(fā)現(xiàn)開創(chuàng)了朊病毒病和其他神經退行性疾病治療領域的一個新途徑。雖然取得了一定的成果，但很多結論都是基于試驗動物模型得到，至今仍未發(fā)現(xiàn)能應用于市場的有效藥物或治療方法。因此，仍然需要科學的不斷創(chuàng)新和探索，繼續(xù)研究PrPC→PrPSc的轉化過程，PrPSc的轉運和清除作用，這樣才能夠在朊病毒病治療上有更大的突破。

［1］Trevitt C R，Collinge J.A systematic review of prion therapeutics in experimental models［J］.Brain，2006，129：2241－2265.

［2］Sim V L，Caughey B.Recent advances in prion chemotherapeutics［J］.Infectious Disorders－Drug Targets，2009，9（1）：81－91.

［3］Brazier M W，Volitakis I，Kvasnicka M，etal.Manganese chelation therapy extends survival in a mouse model of M1000 prion disease［J］.J Neurochemistry，2010，114（2）：440－451.

［4］Ludewigs H，Zuber C，Vana K，etal.Therapeutic approaches for prion disorders［J］.Expert Rev Anti Infect Ther，2007，5（4）：613－630.

［5］Zuber C，Mitteregger G，Pace C.Anti－LRP／LR Antibody W3 Hampers Peripheral PrPScPropagation in Scrapie Infected Mice［J］.Prion，2007，1（3）：207－212.

［6］Zuber C，Knackmussb S，Rey C，etal.Single chain Fv antibodies directed against the 37kDa／67kDa laminin receptor as therapeutic tools in prion diseases［J］.Mol Immunol，2008，45：144－151.

［7］Zuber C，Mitteregger G，Schuhmann N，etal.Delivery of single－chain antibodies（scFvs）directed against the 37／67kDa laminin receptor into mice via recombinant adeno－associated viral vectors for prion disease gene therapy［J］.J Gen Virol，2008，89：2055－2061.

［8］Pfeifer A.Lentivector－mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie－infected mice［J］.J Clin Invest，2006，116（12）：3204－3210.

［9］Pflanz H.Microinjection of lentiviral vectors expressing small interfering RNAs directed against laminin receptor precursor mRNA prolongs the pre－clinical phase in scrapie－infected mice［J］.J Gen Virol，2009，90：269－274.

［10］Gabizon R.Immunoaffinity purification and neutralization of scrapie prion infectivity［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1988，85：6617－6621.

［11］White A Rl.Monoclonal antibodies inhibit prion replication and delay the development of prion disease［J］.Nature，2003，422：80－83.

［12］Carswell C.PAW35Anti－prion protein monoclonal antibodies at low doses effectively treat prion disease in mice without sideeffects［J］.J Neurol Neurosurg Psychiatry，2010，81（11）：33.

［13］Solforosi L.Cross－linking cellular prion protein triggers neuronal apoptosis in vivo［J］.Science，2004，303：1514－1517.

［14］Campana V.Development of antibody fragments for immunotherapy of prion diseases［J］.Biochem J，2009，418：507－515.

［15］Wuertzer C A，Sullivan M A，Qiu X，etal.CNS Delivery of Vectored Prion－specific Single－chain Antibodies Delays Disease Onset［J］.Mol Ther，2008，16（3）：481－486.