湯榮睿，龔雅利

（重慶市沙坪壩區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 400030）

Rho蛋白家族通過其調(diào)節(jié)子、效應(yīng)子，影響腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移［1］，其各成員在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中起著不同的作用。據(jù)此人們推測(cè)Rho蛋白及效應(yīng)子可為抗瘤靶點(diǎn)，抑制其作用可為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。作者介紹昆布多糖硫酸酯（laminarin sulphate，LAMS）對(duì)Rho C蛋白表達(dá)的影響及其效應(yīng)，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 鼠抗人Rho蛋白抗體（美國Santa cruz公司），電泳試劑盒（武漢博士得公司），發(fā)光試劑盒（美國GE公司），蛋白提取液（武漢博士得公司），Transwell侵襲小室（美國Costar公司），ECM膠（美國sigma公司），圖像分析系統(tǒng)（美國BID－RAD公司 Chemi DOCXRS），QGY－7701細(xì)胞（中科院上海細(xì)胞所）。

1.2 方法

1.2.1 LAMS 由重慶市普外科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，多糖酯含量30%。用生理鹽水稀釋成120μg／mL，0.22μL孔徑濾器過濾。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)QGY－7701細(xì)胞，成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后，實(shí)驗(yàn)組加入終濃度分別為12μg／mL及6μg／mL的LAMS，對(duì)照組加入20μL生理鹽水，培養(yǎng)12h，換不含LAMS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，取細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)（各組一式3份）。

1.2.3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) ECM膠包被小室底膜，紫外線消毒。小室置24孔培養(yǎng)板。取上述細(xì)胞，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)液配成1×105。小室內(nèi)加600μL上述細(xì)胞液，小室外加600μL胚胎成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液。37℃、5%CO2培養(yǎng)24h。用棉簽擦去孔內(nèi)細(xì)胞，無水乙醇固定，臺(tái)盼藍(lán)染色。顯微鏡下計(jì)數(shù)10個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 測(cè)定Rho C蛋白表達(dá) 用細(xì)胞刮刮取上述的QGY－7701細(xì)胞，置微量離心管內(nèi)，震蕩混勻后置4℃、30min，取勻漿置離心管中12000r／min離心20min。取上清液測(cè)定蛋白含量，用蛋白提取液將蛋白濃度均調(diào)至3mg／mL。將該組織液經(jīng)100g／L十二烷基硫酸鈉－聚丙稀酰胺凝膠電泳（SOSPAGE），電轉(zhuǎn)于PVDS膜，50g／L脫脂奶粉的TBST溶液封閉，經(jīng)一抗及二抗孵育后，化學(xué)發(fā)光法顯色，圖像分析系統(tǒng)拍攝并用Quantity One軟件將特異條帶灰度數(shù)字化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穿過多孔膜膜細(xì)胞數(shù)目 對(duì)照組、LAMS終濃度6μg／mL、12μg／mL穿過多孔膜的細(xì)胞數(shù)分別為:220±16、82±6、31±5。LAMS終濃度為12μg／mL組較其他兩組有顯著降低（P＜0.01）。LAMS終濃度為6μg／mL組亦較對(duì)照組有顯著降低（P＜0.01）。

2.2 Rho C蛋白表達(dá) MTA1蛋白表達(dá)見圖1，Rho C蛋白表達(dá)系數(shù)見表1（Rho C蛋白表達(dá)系數(shù)＝Rho蛋白積分光密度／βactin蛋白積分光密度）。由圖1及表1可見經(jīng)LAMS處理后QGY7701細(xì)胞的Rho C蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。

圖1 Rho C蛋白表達(dá)

表1 Rho C蛋白表達(dá)系數(shù)（）

表1 Rho C蛋白表達(dá)系數(shù)（）

＃:P＜0.01，與LAMS 12μg比較；＊:P＜0.01，與 LAMS 12μg／mL組比較。

組別 Rho 蛋白表達(dá)對(duì)照組 1.72±0.22＃＊實(shí)驗(yàn)組LAMS 6μg／mL 111.00±0.17＃LAMS 12μg／mL 0.43±0.26

3 討 論

Rho家族蛋白是一類小分子G蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)十余種成員［2］，該家族具有GTP酶活性，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中的信號(hào)轉(zhuǎn)換器［3］。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移所涉及的許多分子事件均有Rho蛋白家族成員參與。它們通過調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)［4］、與細(xì)胞黏附［5］、促進(jìn)細(xì)胞間質(zhì)降解［6］、促進(jìn)腫瘤血管生成［7］等功能，參與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。深入研究Rho蛋白家族成員，具有潛在而重要的臨床價(jià)值。Rho C蛋白屬于Rho CTP酶家族成員，它通過參加細(xì)胞骨架的重組，基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程，促進(jìn)細(xì)胞癌變［8］。有文獻(xiàn)指出Rho C在人類黑色素瘤細(xì)胞系中是遷移和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子［9］。Wang等［10］應(yīng)用 RT－PCR及 Western－blot法測(cè)定不同分化程度肝癌組織中Rho C的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Rho C在肝癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織，在低分化肝癌組織中的表達(dá)高于高分化肝癌組織。Rho C的表達(dá)水平不但與癌組織的惡性程度有關(guān)，且與癌組織的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為肝癌診斷的標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)［10］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LAMS可降低QGY7701細(xì)胞的Rho C蛋白表達(dá)及侵襲力，其效果與濃度呈正相關(guān)，有可能成為抗擊腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物。

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