王斌周雅飛張興鄭峰偉高鈺婷何潔周一兵

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室,遼寧大連116023)

一株沿海灘涂細菌的降油及生長特性研究

王斌1、2,周雅飛1,張興1,鄭峰偉1,高鈺婷1,何潔1,周一兵1、2

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室,遼寧大連116023;2.大連海洋大學遼寧省海洋生物資源恢復與生境修復重點實驗室,遼寧大連116023)

采用以原油為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,從原油污染的沿海灘涂土壤中分離篩選具有降油性能的細菌;采用柴油培養(yǎng)基測定分離菌株對柴油的原始降解率;通過在柴油培養(yǎng)基中添加不同濃度的葡萄糖 (0、1、2、4、8、16 g/L),及不同濃度的酵母膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨 (以氮計,濃度為0.5、1、2 g/L)和磷酸二氫鈉 (0、4、8、12 g/L)后,測定分離菌株的降油性能;鑒定分離菌株并研究其生長特性。結(jié)果表明:共分離到5株能以原油為唯一碳源生長的細菌,其中1株原始降油率最高 (19.0%),編號為Y-3;在添加1 g/L以上葡萄糖時,Y-3菌株降油率升高,添加4 g/L葡萄糖時達最高 (79.9%);酵母膏和蛋白胨可提高Y-3菌株的降油率,尿素、硫酸銨和磷酸鹽對降油率影響不明顯;根據(jù)形態(tài)學、生理生化鑒定以及16S rDNA序列分析,確定Y-3菌株為惡臭假單胞菌Pseudomonasputida,Y-3菌株的最適生長溫度為30℃,最適生長pH為8,適宜生長NaCl濃度為0～30 g/L。

石油降解菌;生理生化鑒定;16S rDNA序列分析;生長特性

海上溢油事故的不斷發(fā)生導致海洋環(huán)境的石油類污染成為世界性的問題,由此造成了部分海灣環(huán)境惡化、生物絕跡[1-2]。石油污染常用的修復方法有物理、化學和生物修復,其中生物修復對人和環(huán)境造成的影響小且修復費用僅為物理、化學修復的30% ～50%[3]。目前,國內(nèi)外對微生物降解石油的研究非常廣泛,應(yīng)用于海洋溢油的降解菌也有較多報道[4-8]。在修復環(huán)境中接種的外源微生物面臨多重壓力:一是土著微生物的競爭作用,二是環(huán)境中生態(tài)因子的適宜性,三是被修復環(huán)境中污染物的環(huán)境毒性。由于這幾方面的壓力使接種的外源微生物的存活率很低或活性較弱,限制了其應(yīng)用效果[4-9],研究細菌的降油性能及其在原位修復中的實際應(yīng)用是目前研究的熱點。本研究中,作者從原油污染的沿海灘涂土壤中分離篩選石油降解菌,同時研究添加不同營養(yǎng)素后細菌的降油性能,以期為海洋溢油的生物處理提供更多的材料及試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 土壤樣品采自遼寧省盤錦市原油污染的灘涂,24 h內(nèi)帶回實驗室進行細菌分離。原油樣品采自盤錦油田,柴油樣品為市售0號柴油。1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基包含NaCl 10 g,NH4Cl 0.5 g,KH2PO40.5 g,K2HPO41 g,KCl 0.01g,MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCl20.002 g, FeSO40.01 g,蒸餾水1 L,pH為7.2,在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。分離富集培養(yǎng)基為100 mL基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基中加入2 g原油,在121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。生長特性及菌種保存培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂斜面(或平板)和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。柴油培養(yǎng)基為100 mL滅菌后的基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基中加入0.1 mL市售0號柴油(115℃下滅菌30min)。營養(yǎng)素添加培養(yǎng)基為100mL基礎(chǔ)無機鹽培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的葡萄糖、氮源(酵母膏、蛋白胨、尿素和硫酸銨)、磷酸二氫鈉,在115℃下滅菌30 min后,再加入滅菌后的柴油。

1.2 方法

1.2.1 降油菌株的分離及篩選 取土壤樣品10 g加入到盛有90mL無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中,振搖約20 min使樣品與水充分混合,靜置后取上清液10 mL,加入到盛有100 mL富集培養(yǎng)基(含原油20 g/L)的三角燒瓶中,在25℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d。將培養(yǎng)液梯度稀釋,涂布到分離富集培養(yǎng)基平板上,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,取單菌落經(jīng)多次分離純化后,轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)瓊脂斜面,保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株原始降油率的測定 將保存的分離菌株接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,在25℃下培養(yǎng)24 h,取2 mL濃度為109cell/mL的菌懸液(顯微直接計數(shù))接種到100 mL柴油培養(yǎng)基中,在25℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,每株細菌各設(shè)3個平行。在SPECTRUM754型紫外分光光度計上掃描柴油的最大吸收波長,在最大波長處測得各組樣品的OD值,按下式計算降油率:

降油率 (D)= (A0-Ai)/A0×100%,

其中:A0為對照組5 d后殘余柴油的吸光度;Ai為試驗組5 d后殘余柴油的吸光度。然后取其平均值并進行統(tǒng)計分析,復篩出降油率較高的菌株[10-11]。

1.2.3 添加碳、氮和磷后菌株降油率的測定 選擇原始降油率最高的分離菌株用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基在25℃下培養(yǎng)24 h,然后分別接種2 mL菌懸液 (濃度為109cell/mL)到100 mL含不同濃度葡萄糖(0、1、2、4、8、16 g/L),不同濃度的氮源,包括酵母膏、蛋白胨、尿素和硫酸銨 (以氮計,濃度分別為0.5、1、2 g/L),不同濃度的磷酸二氫鈉(0、4、8、12 g/L)柴油培養(yǎng)基中,在25℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d,同法測定柴油含量并計算平均降油率,每個梯度各設(shè)3個平行。

1.2.4 菌株的鑒定 根據(jù) 《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》,對復篩所得降油性能最好的菌株進行形態(tài)觀察和生理生化鑒定[12-13],并送寶生物工程 (大連)有限公司測定16S rDNA序列,將測序結(jié)果在Gen-Bank中進行比對,并使用Mega 5軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以此確定其分類位置。

1.2.5 菌株的生長特性

1)適宜生長溫度 將篩選所得降油性能最佳的菌株采用 “1.2.3”中的方法培養(yǎng)后,挑取一環(huán)接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,分別在4、10、20、25、30、37、40℃下靜置培養(yǎng)24 h,每個梯度設(shè)3個平行。以不接種菌株的培養(yǎng)基為對照,測定各試驗組的菌體密度 (OD600nm)。

2)適宜生長NaCl濃度 接種試驗菌株到含NaCl為0、10、20、30、40 g/L的牛肉膏蛋白胨水中,每個梯度設(shè)3個平行,在25℃、150 r/min條件下培養(yǎng) 24 h,測定各試驗組的菌體密度(OD600nm)。

3)適宜生長pH 測定試驗菌株在pH為5、6、7、8、9、10的牛肉膏蛋白胨水中的菌體密度(OD600nm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析,采用Duncan法進行多重比較。

2 結(jié)果

2.1 石油降解菌的分離、篩選

經(jīng)富集培養(yǎng)和分離純化共得到5株能以原油為唯一碳源生長的細菌,編號分別為Y-1、Y-2、Y -3、Y-4、Y-5,其形體特征見表1。盡管原始分離菌株能在以原油為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基上生長,但其對油的利用能力差異極大。因此,選擇以柴油為唯一碳源和能源的培養(yǎng)基對分離菌株的降解能力進行測定,復篩出降油率最高的菌株進行深入研究。

表1 分離菌株的形態(tài)特征Tab.1 Morphological characteristics of the isolated strains

2.2 分離菌株的原始降油性能

在紫外分光光度計上對柴油進行最大吸收波長掃描,得到最大吸收波長為221 nm。在此波長下,測得各組的分光光度值,得出降油率最高(19.0%)為Y-3菌株 (圖1),并以Y-3菌株作為目標菌株進行后續(xù)試驗。

2.3 Y-3菌株在添加碳、氮和磷后的降油性能

添加不同濃度的葡萄糖后,Y-3菌株的降油率均有所提高,當葡萄糖濃度為4 g/L時,降油率可提高到79.9%,說明補充葡萄糖對Y-3菌株的降油性能有明顯的促進作用 (P＜0.01);添加酵母膏和蛋白胨,可明顯提高Y-3菌株的降油率,并隨添加濃度的升高降油率有上升的趨勢(P＜0.01),但尿素、硫酸銨和磷酸鹽對Y-3菌株的降油性能作用不明顯(P＞0.05),如圖2、圖3所示。

圖1 分離菌株的原始降油率Fig.1 Original degradation rate of the crude oil by the isolated strains

圖2 葡萄糖濃度和NaH2PO4濃度對降油率的影響Fig.2 Impact of the concentrations of glucose and NaH2PO4on oil degradation

圖3 不同氮源及其濃度對降油率的影響Fig.3 Impact of the nitrogen sources and concentration on oil degradation

圖4 電鏡下Y-3菌株的形態(tài) (15 000×)Fig.4 Electronic scopy m icrograph of the Y-3(15 000×)

2.4 Y-3菌株的鑒定

1)形態(tài)學特征 Y-3菌株為革蘭氏陰性短桿菌,無芽孢;菌落圓形,光滑,直徑為2～3 mm,乳白色,具運動性;電鏡下見單極生鞭毛 (圖4)。

2)生理生化鑒定 通過對Y-3菌株進行生理生化鑒定,結(jié)果顯示,其與惡臭假單胞菌Pseudomonasputida特征相符 (表2)。

將Y-3菌株的16S rDNA序列測序結(jié)果輸入GenBank進行比對,發(fā)現(xiàn)其與惡臭假單胞菌的同源性達到100%,使用Mega 5軟件構(gòu)建Y-3菌株與假單胞菌屬Pseudomonas屬內(nèi)其它菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,表明Y-3菌株與惡臭假單胞菌聚為一枝 (圖5)。綜上所述,可確定Y-3菌株為惡臭假單胞菌。

2.5 Y-3菌株的生長特性

從圖6可見:Y-3菌株最適生長溫度為30℃; Y-3菌株在NaCl濃度為0～30 g/L時生長情況相差不大,在40 g/L時生長驟減,表明該菌株可耐鹽生長;最適生長pH為8。

3 討論

本研究中從分離獲得的幾株原油降解菌中選擇原始降油率相對較高的Y-3菌株,進行了不同營養(yǎng)素添加后對柴油降解性能的測定,發(fā)現(xiàn)添加少量葡萄糖可明顯提高其對柴油的降解能力,提高幅度優(yōu)于添加不同有機氮。細菌的原始降油率通常不高[14-16],有學者認為石油可提供微生物碳源,但N、P營養(yǎng)的缺乏往往是影響細菌生長繁殖的主要原因,補充氮源有助于提高原始降油率[17-18]。本研究中發(fā)現(xiàn),有機氮可提高試驗菌對柴油的降解率,但添加葡萄糖對分離菌降油率的提升作用強于添加各種氮源,此種現(xiàn)象目前鮮見報道。微生物在降解環(huán)境特殊污染物質(zhì)的過程中存在 “共代謝”作用[19],關(guān)于 “共代謝”的研究目前多見于環(huán)境廢水中特殊難降解物質(zhì)的微生物代謝過程[20-21]。鑒于Y-3菌株對柴油的原始降解率較低,而在添加基礎(chǔ)碳源后其降油率明顯提高,推測Y-3菌株對柴油中的某些成分可能存在 “共代謝”現(xiàn)象,這為今后利用微生物在原位或異位石油污染修復過程中,提高菌體的降油效能提供了新的立足點,Y -3菌株對柴油中哪些成分存在 “共代謝”還有待于深入的研究。

圖5 Y-3菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of Y-3

表2 Y-3菌株的生理生化特征Tab.2 Biochem ical and physiological characteristics of thestrain Y-3

圖6 Y-3菌株適宜生長溫度、NaCl濃度和pHFig.6 The optimal tem perature,NaCl concentration,and pH for Y-3 grow th

本研究中分離的Y-3菌株經(jīng)生理生化特征和16S rDNA序列測定及比對,鑒定為惡臭假單胞菌。有關(guān)假單胞菌屬降解石油的報道很多[11,6-7,22],但大多未鑒定到種。關(guān)于惡臭假單胞菌對長鏈烷烴、多環(huán)芳香烴等降解機制的研究較多,但對其在石油污染修復中應(yīng)用的報道較少。本研究中報道的Y-3菌株生長的溫度、NaCl濃度、pH范圍均適合海洋環(huán)境,因此,Y-3菌株可作為海洋石油污染修復菌種進行研究和開發(fā),尤其對于石油各組分的降解能力及代謝機制,降解基因的存在方式及其調(diào)控機制是今后研究的重點。

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The grow th and petroleum degradation characteristics of bacteria in coastal beach

WANG Bin1,2,ZHOU Ya-fei1,ZHANG Xing1,ZHENG Feng-wei1,GAO Yu-ting1,HE Jie1,ZHOU Yi-bing1,2
(1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea,Ministry of Agriculture,Dalian Ocean University,Dalian 116023, China;2.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalain Ocean University,Dalian 116023,China)

The bacteria that have capability to degrade crude oil were isolated from the coastal beach polluted by crude oilwith the basalmedium crude oil as only carbon source.The original degradation rate of diesel oil by the isolated strains was determined.In addition,the degradation rate of diesel oil by the isolated strain was determined with the basalmedium diesel oil including different concentration of glucose(0,1,2,4,8,16 g/L),the different concentrations of yeast extract,peptone,carbamide,(NH4)2SO4(according to the content of nitrogen:0.5, 1,2 g/L)and NaH2PO4(0,4,8,16 g/L).The isolated strain was identified and growth characteristicswere studied.The results showed:5 strains bacteria grew on the basalmedium crude oil as only carbon source.One of these stains had amaximum original degradation rate(19.0%)and was numbered as Y-3.The degradation rate of Y-3 increased and reached to 79.9%in the diesel oilmedium supplemented with glucose(4 g/L).The degradation rate was increased in Y-3 in addition of yeastextractand peptone also,butnotnotable in added urea,(NH4)2SO4and NaH2PO4.The Y-3 was identified asPseudomonasputidaaccording to the resultof themorphology,physiological characteristics and 16S rDNA sequence analysis.The Y-3 had fitting growth at temperature of 30℃,pH 8, and NaCl concentration of 0-30 g/L.

diesel oil;biodegradation;bacterial identification;growth characteristics

X172

A

2095-1388(2012)04-0306-05

2012-12-01

國家 “863”計劃項目 (2006AA10Z410);國家海洋公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目 (200805069)

王斌 (1962-),女,教授。E-mail:wangbin@dlou.edu.cn

周一兵 (1957-),男,教授。E-mail:ybzhou@dlou.edu.cn