楊靜娟，鐘世安

(中南大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，湖南 長沙，410083)

玉竹為百合科黃精屬植物玉竹 Polygonatum odoratum (Mill) Druce的干燥根莖，屬藥食兩用植物，味甘平，性微寒，具有滋陰潤燥、養(yǎng)胃生津之功效[1]。而玉竹提取物多糖具有降血糖、增強免疫功能、改善心血管系統(tǒng)、抗腫瘤、抗衰老等功能[2]，因此，開發(fā)玉竹多糖有著很好的前景。多糖是極性大分子化合物，大多采用不同溫度的水、稀堿或稀鹽溶液提取[3-5]，但同一原料分別用水、酸、堿、鹽或酶法提取所得多糖分子量與結(jié)構(gòu)是不相同的。提取液經(jīng)濃縮后以甲醇或乙醇、丙酮等溶劑沉淀析出得多糖。除了傳統(tǒng)的水提取外，近年來研究還采用一些輔助手段提取多糖，例如超聲波輔助提取法[6-7]、微波輔助提取[8-9]等方法。韓剛等在 50%乙醇中加入 0.5%的十二烷基磺酸鈉(SDS)使中藥姜黃中姜黃素的提取率增加了 16%；加入 0.8%的 SDS 使大黃中總蒽醌的提取率增加了20%。用水煮醇沉淀法提取黃芩苷，加入吐溫-80，使其提取率也得到了提高[10-11]。使用丙烯酸、丙烯酸丁酯和苯乙烯的共聚物CPS 表面活性劑，在沒有有機溶劑存在的條件下乳液萃取番茄紅素，然后破乳使番茄紅素析出，番茄紅素的萃取效果與使用 1，2-二氯乙烷等溶劑相同[12]，基于這些啟發(fā)，本文作者利用水和表面活性劑 DBS(十二烷基苯磺酸鈉)、CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)及 OP-10(辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10)來提取玉竹多糖，在單因素實驗中分別考察了表面活性劑的用量、提取溫度、提取時間、料液比以及提取次數(shù)對多糖提取率的影響。在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上以玉竹多糖提取溫度、提取時間和料液比3個因素與玉竹多糖提取產(chǎn)量進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，優(yōu)化玉竹提取條件。通過 Design Expert 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,預(yù)測玉竹多糖提取的最優(yōu)產(chǎn)率[13-15]。

1 實驗

1.1 材料與儀器

原料：玉竹，購買于長沙市大藥房；試劑：去離子水；表面活性劑DBS，CTAB，OP-10，無水乙醇，正丁醇，辛烷，正己烷，異丁醇等試劑均為分析純。

設(shè)備：R201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申科器械研究所生產(chǎn)；TGL-16G離心機，上海安亭科學(xué)廠生產(chǎn)；DZF-6021真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同表面活性劑協(xié)助提取玉竹多糖及最佳表面活性劑的確定

稱取5.0 g曬干粉碎的玉竹根莖，與100.0 mL的去離子水和一定量的表面活性劑在 85 ℃恒溫水浴條件下進行玉竹多糖的提取。表面活性劑分別為DBS，CTAB和 OP-10。表面活性劑的用量與相應(yīng)的多糖的產(chǎn)量見表 1～3，其中玉竹多糖產(chǎn)量的測定采用的是苯酚硫酸法，以葡萄糖為對照品，利用其標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以濃度與吸光度作線性回歸，回歸方程A=0.011 5C+0.002 3，γ=0.999 3，12.30～43.01 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，同樣利用紫外-可見分光光度法測定玉竹多糖樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品溶液的中多糖含量，進而計算玉竹多糖的提取率[16]。

1.2.2 單因素實驗提取玉竹多糖

從表1～3的結(jié)果可以看出：最有效的表面活性劑為DBS，且在其用量為0.60 g/100 mL水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%)時獲得最高產(chǎn)量的玉竹多糖。為了進一步探索提高玉竹多糖的提取率，以下實驗都選擇0.6% DBS的溶液為提取劑。

稱取一定量的干燥粉碎的玉竹根莖與 0.6%DBS溶液混合，料液比(體積與質(zhì)量比)分別定位5，10，15與20 mL/g，在提取溫度為70，80，90和100 ℃，提取時間為0.5，1.0，1.5與2.0 h條件下進行玉竹多糖的提取。

在單因素的最優(yōu)提取條件下，分次浸提玉竹多糖，依次收集提取液，直至浸取液無色，比較其提取率。提取次數(shù)為1～4次[17]。

1.2.3 響應(yīng)面實驗提取玉竹多糖

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以玉竹多糖提取溫度(X1)、提取時間(X2)、料液比(X3) 3個因素與玉竹多糖產(chǎn)量進行響應(yīng)面實驗設(shè)計，優(yōu)化玉竹多糖提取條件。通過Design Expert 7.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，預(yù)測玉竹多糖提取的最優(yōu)提取參數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類表面活性劑對玉竹多糖提取率的影響

表1～3顯示了3種表面活性劑的用量及其相應(yīng)的多糖產(chǎn)量。由表1～3可以看出：3種表面活性劑都能有效提高多糖的產(chǎn)量，且隨著表面活性劑用量的增加多糖的產(chǎn)量也會增加。但表面活性劑DBS較之CTAB與OP-10能更有效，且在用量為0.6 g時，多糖的產(chǎn)量達到最高值0.45 g，此時多糖提取率為9%，比只用純水作提取劑時(4%)提高了 125%。但同時也看到當(dāng)表面活性劑的用量超過一定范圍時多糖的產(chǎn)量反而有所下降，這是因為在溶液中表面活性劑的濃度超過其臨界濃度時就會以膠束的形式存在，且表面活性劑的濃度越大，膠束也就越大，而溶液中游離的表面活性劑反而越少，所以多糖的產(chǎn)量也會下降。

表1 表面活性劑DBS對玉竹多糖提取產(chǎn)量的影響Table 1 Effect of CTAB on yield of polygonatum polysaccharides (85℃, 1:20)

2.2 提取溫度對玉竹多糖提取率的影響

提取溫度在70～90 ℃范圍內(nèi)，玉竹多糖提取量呈上升的趨勢見圖 1(a)，溫度超過 90 ℃時，多糖產(chǎn)量反而有所下降。其原因是在較低提取溫度時多糖的溶出速率緩慢，而在較高提取溫度時多糖的溶出加速，但過高的溫度會破壞多糖的結(jié)構(gòu)，使其產(chǎn)量有所下降。因此，玉竹多糖的最佳提取溫度為90 ℃。

2.3 提取時間對玉竹多糖提取率的影響

由圖1(b)可知：提取時間在0.5～1.5 h范圍內(nèi)，玉竹多糖提取產(chǎn)量不斷提高，當(dāng)提取時間超過1.5 h時，原料中多糖的溶出量達到平衡，多糖提取產(chǎn)量無顯著變化。從生產(chǎn)成本考慮，提取時間越長，能耗越大，故提取時間以1.5 h為宜。

表2 表面活性劑CTAB對玉竹多糖提取產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of CTAB on yield of polygonatum polysaccharides (85℃, 1:20)

表3 表面活性劑OP-10對玉竹多糖提取產(chǎn)量的影響Table 3 Effect of OP-10 on yield of polygonatum polysaccharides (85℃, 1: 20)

圖1 提取溫度(a)、提取時間(b)、料液比(c)以及提取次數(shù)(d)對玉竹多糖產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of extracting temperature (a), extracting time (b), ratio of 0.6%DBS solution to raw material (c) and extracting times(d) on yield of polygonatum polysaccharides

2.4 料液比對玉竹多糖提取率的影響

由圖 1(c)可知：料液比在10～20范圍內(nèi)，玉竹多糖提取產(chǎn)量顯著提高，其原因可能是隨著料液比的增加多糖的傳質(zhì)動力也增加，使得原料中更多的多糖融入提取劑中[18]。當(dāng)料液比超過20 mL/g時，多糖的提取產(chǎn)量沒有顯著變化，因此，玉竹多糖提取最佳料液比為20 mL/g。

2.5 提取次數(shù)對玉竹多糖提取率的影響

從圖1(d)可知：玉竹多糖的提取次數(shù)越多，其提取產(chǎn)率越高。第4次與第3次的多糖產(chǎn)率沒有顯著差異，從生產(chǎn)成本考慮，提取次數(shù)越多，能耗越大，同時在多糖純化和濃縮時會造成部分多糖流失而降低成品得率，故提取次數(shù)以3次為宜。

2.6 響應(yīng)面分析實驗

對玉竹多糖提取溫度(X1)、提取時間(X2)和料液比(X3)進行了三因素三水平的響應(yīng)面分析實驗，實驗設(shè)計與結(jié)果見表 4。利用 Design Expert 7.0中Box-Behnken軟件對表4數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得到玉竹多糖提取產(chǎn)量預(yù)測值Y對編碼自變量X1，X2和X3的二次多項回歸方程：

對上述回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表 5。由表 5可見：模型是顯著的(P＜0.001)，其決定系數(shù)為0.982，說明該模型能夠解釋98.2%的變化且對玉竹多糖提取產(chǎn)量的分析和預(yù)測具有指導(dǎo)意義。此外，在P=0.05水平上對多糖的提取率影響高度顯著的因素是X1的一次作用與X3的一次作用以及X1的二次作用以及X3的二次作用。

表4 響應(yīng)面分析方案與實驗結(jié)果Table 4 Experimental design and extraction rate of PPS with Box-Behnken software

表5 回歸模型方差分析Table 5 Regression coefficients estimate and their significance test for quadratic polynomial model

2.7 玉竹多糖提取率響應(yīng)面優(yōu)化

利用Design Expert 軟件對表4 數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，所得的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖 2～4。

提取溫度和提取時間的交互作用對玉竹多糖提取產(chǎn)量的影響非常顯著(見圖2)。等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強弱大小，橢圓表示兩因素交互作用顯著[19]。玉竹多糖的產(chǎn)量隨著提取溫度的提高和提取時間的加長有一個急劇增加的趨勢。提取溫度較低時，要想得到較高產(chǎn)量的多糖必須加長提取時間，提取溫度較高時，在較短的提取時間內(nèi)就可以得到較高產(chǎn)量的多糖。由此可見：適當(dāng)提高提取溫度，縮短提取時間可以提高玉竹多糖的提取率。

從圖3可以看出：在提取時間為1.5 h時，提取溫度與料液比對玉竹多糖提取產(chǎn)量的交互作用也是較為顯著的。溫度低于 90 ℃時，需要加大料液比才能提高多糖產(chǎn)量，當(dāng)溫度處在90～92.5 ℃之間時，玉竹多糖產(chǎn)量隨料液比變化的影響不明顯，高于92.5 ℃，又會隨著料液比的增大而增加，但是當(dāng)料液比固定時，隨著溫度的進一步提高，多糖的產(chǎn)量會降低，這是因為在過高溫度下，多糖分子結(jié)構(gòu)受到了破壞而容易分解。

圖2 提取溫度和提取時間的交互作用對玉竹多糖提取產(chǎn)率的影響Fig.2 Effects of interaction of extracting temperature and extracting time on yield of polygonatum polysaccharides

圖3 提取溫度與料液比的交互作用對玉竹多糖產(chǎn)率的影響Fig.3 Effects of extracting temperature and ratio of 0.6% DBS solution to raw material on yield of polygonatum polysaccharides

圖4 提取時間與料液比的交互作用對玉竹多糖產(chǎn)率的影響Fig.4 Effects of extracting time and ratio of 0.6% DBS solution to raw material on yield of polygonatum polysaccharides

提取溫度為 90 ℃，提取時間和料液比對玉竹多糖產(chǎn)量的交互作用很顯著(見圖4)。多糖的產(chǎn)量隨著料液比的增加和提取時間的加長成直線增加趨勢，其原因是溶劑分子量的增加會影響多糖分子的擴散與糊化程度，從而影響原料的流變性能，原料中的多糖可以更加緊密的與溶劑分子結(jié)合，這種結(jié)合使玉竹多糖的產(chǎn)量得到了提高[20]。

2.8 實驗性驗證

在提取溫度為90 ℃、提取時間為1.5 h、料液比為 20 mL/g的最佳單因素條件下玉竹多糖的產(chǎn)率為10.87%，而通過對玉竹多糖提取產(chǎn)量的二次多項數(shù)學(xué)模型解逆矩陣，得出玉竹多糖在提取溫度為92 ℃、提取時間為1.61 h、料液比為19.93 mL/g的條件下，其最大提取產(chǎn)率預(yù)測值為11.11%，在此條件下的提取產(chǎn)量比單因素組合的最佳提取條件下的產(chǎn)量高出2.2%。

3 結(jié)論

(1) 本研究借助多種表面活性劑(DBS，CTAB和OP-10)表面活性劑協(xié)助提取玉竹多糖，使玉竹多糖的提取率得到了大大提高。在提取溫度為 85 ℃，料液比為20 mL/g時，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的DBS溶液使多糖提取率達到最高值(9%)，比只用純水做提取劑時(4%)提高了125%。

(2) 利用表面響應(yīng)法優(yōu)化玉竹多糖提取參數(shù)，建立的玉竹多糖提取產(chǎn)率的二次多項數(shù)學(xué)模型具有顯著性(P＜0.001)，其決定系數(shù)為0.982，預(yù)測到最佳提取條件為：提取溫度 92 ℃，提取時間 1.61 h，料液比19.93 mL/g，此條件下玉竹根莖中多糖提取產(chǎn)率高達11.11%。

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