房敏峰，吳 洋，王啟林，岳 明，趙桂仿

(西部資源生物與現(xiàn)代生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

遠(yuǎn)志主流商品為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根，分布于我國(guó)沙漠以南和長(zhǎng)江以北，主產(chǎn)于山西、陜西、河南和河北，傳統(tǒng)認(rèn)為“山西量大，陜西質(zhì)優(yōu)”［1］。遠(yuǎn)志具有安神益智、交通心腎、祛痰和消腫作用，用于心腎不交引起的失眠多夢(mèng)、健忘驚悸、神志恍惚、咳痰不爽、瘡瘍腫毒和乳房腫痛［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，遠(yuǎn)志具有抗氧化、抗衰老、降壓、抗癡呆和腦保護(hù)作用，具有抑菌抗炎、調(diào)節(jié)血脂及抗突變、抗癌等多種藥理活性。遠(yuǎn)志的藥理活性主要與其水溶性成分即皂苷、酮和寡糖酯等有關(guān)［3］。前人對(duì)不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志指標(biāo)成分含量、指紋圖譜及成分與環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行了較系統(tǒng)研究［4－8］，但遠(yuǎn)志道地與非道地產(chǎn)區(qū)的有效組分有何特征尚未見報(bào)道。因此，本文以50%甲醇為溶劑，分析遠(yuǎn)志道地與非道地產(chǎn)區(qū)藥材的組分特征，為道地遠(yuǎn)志質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

島津LC－10AT vp高效液相色譜儀(SPD－10A vp紫外檢測(cè)器，SHIMADZU CBM－102色譜工作站)，F(xiàn)A2004萬分之一電子天平(中國(guó)上海良平儀器儀表有限公司)，Autoscience AS5150A型超聲波清洗儀。

1.2 試 藥

樣品2007～2009年8月采自陜西(合陽、商州和長(zhǎng)安)、山西(平遙、平順和永濟(jì))、河北(淶源和圍場(chǎng))、河南(盧氏和輝縣)、內(nèi)蒙古(呼和浩特和包頭)、山東(費(fèi)縣)、遼寧(錦州和北票)、黑龍江(肇東)、四川(茂縣)和安徽(蕭縣)，共10個(gè)省區(qū)18個(gè)縣市，野生，按中國(guó)藥典方法加工成遠(yuǎn)志藥材。經(jīng)西安市藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所謝志民研究員鑒定，遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根。

2 方法與方法

2.1 方法

2.1.1 色譜條件

色譜柱:SHIMADZU VP－ODS(150 mm ×4.6 mm，5μm);流動(dòng)相:乙腈－0.05%磷酸溶液，梯度洗脫(0.00、10.01、20.01 、52.01、57.01、65.01、85.01 min，乙腈依次為 15%、20%、23%、27%、32%、35%、40%);檢測(cè)波長(zhǎng):310nm;柱溫:25℃;流速:1 mL·min－1;進(jìn)樣量:20 μL;記錄時(shí)間:120 min。參比峰為3，6'－二芥子?；崽酋ィ?］(見圖1)。

圖1 陜西合陽野生遠(yuǎn)志HPLC色譜圖

2.1.2 對(duì)照藥材溶液的制備

精密稱取已恒重的遠(yuǎn)志對(duì)照藥材約0.4 g，加50%甲醇10 mL，超聲30 min，過濾，濾液用50%甲醇定容至10 mL量瓶中，備用。

2.1.3 供試品溶液的制備

精密稱取已恒重的遠(yuǎn)志藥材粉末(20～40目)約1.0000 g，加 50% 甲醇 25 mL，超聲 30 min，過濾，濾液用50%甲醇定容至25 mL量瓶中，臨用前過0.45 μm濾膜，即為供試品溶液。

2.1.4 測(cè)定方法

分別精密吸取對(duì)照藥材溶液和18批野生遠(yuǎn)志藥材的供試液各 20 μL，注入液相色譜儀，記錄120 min內(nèi)的色譜圖。

2.1.5 數(shù)據(jù)處理

指紋圖譜結(jié)果分析在藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”軟件下完成;聚類分析在 STATISTICA 6.0 for Windows軟件下完成。

2.2 結(jié) 果

2.2.1 精密度試驗(yàn)

取陜西合陽遠(yuǎn)志藥材(s1)粉末，按1.3.1項(xiàng)方法制備供試液，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積無明顯變化，其 RSD分別為 0.02% ～2.49和0.24% ～2.05%，符合指紋圖譜要求，儀器精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取陜西合陽遠(yuǎn)志藥材(s1)粉末，按1.3.1項(xiàng)方法制備供試液，分別于 0，2，4，6，8，12h 檢測(cè)指紋圖譜。結(jié)果表明各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積無明顯變化，其 RSD分別為0.12% ～2.73%和 0.32% ～2.19%，符合指紋圖譜要求，樣品穩(wěn)定性良好。

2.2.3 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取陜西合陽遠(yuǎn)志藥材(s1)粉末5份，按2.1.3項(xiàng)方法制備供試液，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)保留峰面積無明顯變化，其RSD 分別為0.40% ～2.49%和 0.84% ～2.21%，符合指紋圖譜要求，方法重現(xiàn)性良好。

2.2.4 遠(yuǎn)志HPLC指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果

采用梯度洗脫法得到遠(yuǎn)志道地與非道地產(chǎn)區(qū)18個(gè)居群藥材的HPLC指紋圖譜，通過多點(diǎn)校正取得共有模式(圖2)，共有色譜峰24個(gè)。不同產(chǎn)地與合陽遠(yuǎn)志(s1)的相似度依此為:合陽(s1)1、商州(s2)0.775、長(zhǎng)安(s3)0.773、平遙(s4)0.698、平順(s5)0.856、永濟(jì)(s6)0.722、淶源(s7)0.588、圍場(chǎng)(s8)0.624、盧氏(s9)0.560、輝縣(s10)0.672、呼和浩特(s11)0.752、包頭(s12)0.661、費(fèi)縣(s13)0.671、錦州(s14)0.647、北票(s15)0.603、肇東(s16)0.600、茂縣(s17)0.566 和蕭縣(s18)0.740。其中山西平順與合陽相似度最高為0.856，其次為商州(0.775)和長(zhǎng)安(0.773)。s1－s18與共有模式的相似度依此為:0.807、0.942、0.967、0.860、0.850、0.808、0.796、0.792、0.763、0.884、0.930、0.888、0.906、0.800、0.86、0.832、0.781、0.930。

圖2 道地與非道地產(chǎn)區(qū)野生遠(yuǎn)志藥材HPLC指紋圖譜及其共有模式

由圖2可見，色譜峰2、7、16和22為18個(gè)產(chǎn)地共有成分，峰面積相對(duì)較大，較穩(wěn)定，為主要特征成分，依次為酮Ⅲ、3，6'－二芥子?；崽酋ァ⒃碥誂 和皂苷 B［6－8］。

2.2.5 遠(yuǎn)志水溶性組分特征分析

以3，6'－二芥子酰基蔗糖酯(色譜峰7)作為參比峰計(jì)算4個(gè)主要特征成分，即色譜峰2(14.228min，酮Ⅲ)、色譜峰 7(21.688min，3，6'－二芥子?；崽酋?、色譜峰16(63.109min，遠(yuǎn)志皂苷 A)和色譜峰22(89.608 min，遠(yuǎn)志皂苷B)［1，8］的組成比例，結(jié)果見表 1。圍場(chǎng)和費(fèi)縣 4 個(gè)成分的配比變化較大。

表1 不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志4個(gè)主成分的組成

將4個(gè)特征組分的峰面積按照3，6'－二芥子?；崽酋ド蚺帕校援a(chǎn)地為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制不同產(chǎn)地4個(gè)特征組分的變化曲線，結(jié)果見圖4。合陽和永濟(jì)的組分特征最為接近，費(fèi)縣16號(hào)峰(tR=63.109)導(dǎo)致的組分特征變化最為明顯。

圖4 遠(yuǎn)志4個(gè)主要組分變化曲線

2.2.6 遠(yuǎn)志水溶性特征組分聚類結(jié)果

以參比峰為基礎(chǔ)，對(duì)4個(gè)主要特征成分進(jìn)行峰面積標(biāo)準(zhǔn)化，采用組內(nèi)全部聯(lián)結(jié)法進(jìn)行歐氏距離聚類，結(jié)果見圖5。18個(gè)居群聚為4大支，其中合陽－平順支(Ⅰ)為遠(yuǎn)志現(xiàn)今道地產(chǎn)區(qū)，商州－肇東支(Ⅱ)為非道地產(chǎn)區(qū)，費(fèi)縣支(Ⅲ)為遠(yuǎn)志歷史上的道地產(chǎn)區(qū)［9］;圍場(chǎng)支(Ⅳ)為遠(yuǎn)志非藥用區(qū)。在各支中歐氏距離最近的居群生態(tài)環(huán)境或地理距離最近，如合陽和永濟(jì)、平遙和蕭縣均為逸生或半野生狀態(tài)，采于栽培遠(yuǎn)志田周邊荒地或田埂;長(zhǎng)安和茂縣2個(gè)居群均生于山地灌叢下。山東費(fèi)縣居群的巖石地質(zhì)背景與黃土高原截然不同，而圍場(chǎng)居群生于杏林下砂地，當(dāng)?shù)刂嗅t(yī)很少使用。該聚類結(jié)果提示，遠(yuǎn)志有效成分群與居群生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)。

圖5 道地與非道地遠(yuǎn)志水溶性特征組分聚類圖

3 討論

3.1 道地藥材的質(zhì)量和臨床療效明顯優(yōu)于其他地區(qū)，這是由于藥用植物在不同生境下其次生代謝產(chǎn)物的組成或含量發(fā)生了變化，如茅蒼術(shù)的揮發(fā)油組分及含量隨產(chǎn)地不同而出現(xiàn)變異［10］。目前，研究藥材道地與非道地化學(xué)變異首選為指紋圖譜技術(shù)，因?yàn)樯V圖中所顯示的峰數(shù)及峰高/峰面積，代表了藥材中化學(xué)成分的種類及含量。通過指紋圖譜的特征性，能有效鑒別樣品的真?zhèn)位虍a(chǎn)地;通過指紋圖譜主要特征峰的面積或比例的制定，能有效控制樣品的質(zhì)量，確保樣品質(zhì)量的相對(duì)穩(wěn)定，適于有效成分及作用機(jī)理尚不完全明確藥材的質(zhì)量控制和鑒別。遠(yuǎn)志的道地產(chǎn)區(qū)市場(chǎng)公認(rèn)為陜西合陽一帶，其道地性必然存在相應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示，HPLC指紋圖譜可提供不同產(chǎn)地遠(yuǎn)志藥材的主要組分特征，顯示出道地產(chǎn)區(qū)藥材有別于其它產(chǎn)區(qū)藥材，可用于遠(yuǎn)志道地與非道地藥材的鑒別。

3.2 按共有色譜峰計(jì)算相似度，則山西與陜西產(chǎn)野生遠(yuǎn)志的相似度較高，陜西商洛、長(zhǎng)安和內(nèi)蒙古呼和浩特產(chǎn)野生遠(yuǎn)志之間的相似度大于0.940，表明遠(yuǎn)志藥材的化學(xué)組分與環(huán)境關(guān)系密切。不同產(chǎn)地4個(gè)主成分變異分析顯示，陜西合陽和山西永濟(jì)的主要成分組成特征最為接近，分別為 0.39∶1∶0.80∶1.03和0.39∶1∶0.72∶1.01，而山東費(fèi)縣變化最大，為0.44∶1∶2.04∶0.34。以化學(xué)組分特征為基礎(chǔ)的聚類結(jié)果和相似度計(jì)算結(jié)果相一致。

3.3 關(guān)于遠(yuǎn)志道地沿革，《別錄》記載“生太山及冤句川谷”。陶弘景:“今此藥猶從彭城北蘭陵來”。蘇頌:“今河、陜、洛西州郡亦有之”?！八讉饕拈T出者最佳”?！暗赖匾拈T”?！端幬锍霎a(chǎn)辨》:“產(chǎn)山西曲沃縣、河南省禹州府”。現(xiàn)時(shí)以山西產(chǎn)量大，陜西質(zhì)量?jī)?yōu)［9］。遠(yuǎn)志道地產(chǎn)區(qū)是否沿徐州－開封－合陽緯度線西移并向南北擴(kuò)散，通過哪些遷移路線和擴(kuò)散方式形成了現(xiàn)今的分布格局，兩地藥材是否存在功效差異，需要進(jìn)行本草考證和進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

3.4 道地藥材是中醫(yī)藥臨床對(duì)質(zhì)優(yōu)效佳藥材的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，是中藥資源研究的核心理論之一。遠(yuǎn)志的活性成分類群較多，包括皂苷、酮、寡糖酯、生物堿、多糖及脂肪油，其藥理作用各有側(cè)重，在不同產(chǎn)地或商品規(guī)格中含量也存在差異，但遠(yuǎn)志的臨床療效是上述成分組群綜合作用的結(jié)果，因此分析遠(yuǎn)志道地與非道地藥材之間是否存在化學(xué)型差異，為表征道地遠(yuǎn)志尋找化學(xué)標(biāo)記。

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