陳虹，李俊岑，黨彥麗，劉姿辰，楊拯，張曉

脊髓是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中極易受損的部位，脊髓損傷(SCI)的致殘率高，嚴(yán)重危及人類的健康。脊髓損傷后的修復(fù)一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難點(diǎn)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)由 Levi-Montgalcini在 1953年首先發(fā)現(xiàn)，是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTFs)的典型代表，TrkA是其受體[1]。脊髓損傷后NGF在一定的條件下，可促進(jìn)未損傷神經(jīng)元出芽，重建被破壞的神經(jīng)回路。NGF在體內(nèi)和離體條件下都具有維持神經(jīng)元存活，促使軸突延伸等功能，對(duì)脊髓損傷的重建具有重要作用[2-3]。電針療法屬于針灸療法的一種，是將神經(jīng)電刺激療法與中醫(yī)針灸療法相結(jié)合而形成的。針刺入腧穴得氣后，在針灸針具上通以接近人體生物電的微量電流，利用針和電兩種刺激相結(jié)合，提高針刺的治療效果。已有研究證明，電針能夠促進(jìn)NTFs的表達(dá)，維持周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)的生長(zhǎng)、存活及修復(fù)，促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[4-5]。電針治療可通過促進(jìn)NGF及其受體TrkA的表達(dá)來使受損神經(jīng)元得到修復(fù)，從而修復(fù)脊髓損傷。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD大鼠72只，雌雄不限，體重(180±20)g，由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。分籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20℃～25℃。隨機(jī)分為3組：損傷對(duì)照組(n=24)、電刺激組(n=24)和正常組(n=24)，各組再分成于造模后l d、3d、5 d、7 d小組，每小組6只。

1.2 動(dòng)物模型制備 損傷對(duì)照組和電刺激組大鼠均用1.5%戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔注射麻醉。背部剃毛，常規(guī)消毒。以T9為中心，縱行切開皮膚及皮下組織，剝離椎旁肌肉并暴露棘突與椎板，咬除T9椎板，按Allen法[6]用10 g沖擊棒自25 mm高處自由墜落致傷脊髓。縫合傷口。術(shù)后小心護(hù)理，獨(dú)籠飼養(yǎng)，協(xié)助大鼠排尿，每日早晚各1次，至排尿反射恢復(fù)；每日注射青霉素80000 U和生理鹽水2 ml，抗菌和補(bǔ)充體液，持續(xù)至大鼠取材為止。注意觀察皮膚有無壓瘡或感染，下肢有無潰爛。正常組大鼠切除相應(yīng)椎板后縫合傷口。

1.3 電刺激 術(shù)后24 h起對(duì)電刺激組大鼠進(jìn)行經(jīng)皮電刺激30 min，每天1次，至動(dòng)物取材。參數(shù)設(shè)置：疏密波脈沖電流，電流強(qiáng)度中檔，刺激頻率10 Hz，正極接T7右側(cè)夾脊穴位置的皮膚，負(fù)極接右下肢足三里穴位置的皮膚。

1.4 運(yùn)動(dòng)功能 各組大鼠在術(shù)后1 d、3d、5 d、7 d按Basso,Beattie&Bresnahan(BBB)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)定[7]。

1.5 取材 各組大鼠在術(shù)后1 d、3d、5 d、7 d進(jìn)行取材。用過量的戊巴比妥鈉過度麻醉大鼠，自左心室插管后剪開右心耳，灌注加入肝素鈉與普魯卡因的冰生理鹽水直到有澄清液從右心耳流出，再灌注4%多聚甲醛1 h。打開椎弓管，切除T7～T11段脊髓，固定24 h后放入自動(dòng)脫水包埋機(jī)處理。修片，連續(xù)切片，片厚5μm，連續(xù)5張進(jìn)行貼片、烤片，備用。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 非生物素二步法進(jìn)行NGF免疫組化染色。將各組切片置于二甲苯中脫蠟，梯度酒精水化，高壓熱抗原修復(fù)，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，正常山羊血清封閉非特異性抗原。滴加NGF抗體(效價(jià)1∶20)，4℃冰箱過夜。用兔抗鼠二抗37℃恒溫孵育60 min，在切片上加入DAB-H2O2顯色液，室溫下反應(yīng)，顯微鏡下顯色充分，及時(shí)用0.01 mol/L PBS漂洗；蘇木素復(fù)染，梯度灑精逐級(jí)脫水，二甲苯透明，樹膠封片。顯微鏡下觀察NGF的表達(dá)，陽性結(jié)果為棕黃色反應(yīng)。

1.7 Western blot 各組大鼠在脊髓損傷后1 d、3d、5 d、7 d深度麻醉后迅速取材，研磨充分。按照每g組織3 ml蛋白裂解/抽提試劑(應(yīng)含抑制劑)冰水浴上超聲5次，每次2 s，間隔10 s；-20℃放置1 h后，10000 g離心30 min，取上清，280 nm紫外光吸收法初步測(cè)定蛋白濃度。電泳分離，洗板(薄厚共2塊)用洗潔精清洗，自來水沖凈，去離子水反復(fù)沖洗，組裝玻璃板，將其水平放置。制備8%分離膠溶液5 ml，取3.4 ml加入玻璃板中，覆蓋一層異丙醇(約2 ml)；分離膠聚合完全后(約30 min)，傾出覆蓋層，用去離子水清洗凝膠頂部數(shù)次以去除殘留未聚合的丙烯酰胺。盡可能排除凝膠上液體，再用濾紙吸凈殘留水。制備5%積層膠溶液5 ml，加入玻璃板至灌滿。待積層膠聚合完全后(約30 min)，置于4℃冰箱中過夜，使之聚合充分。取出凝膠板置于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，使之減凍至室溫。在樣品中按1∶4體積比加入5×SDS凝脂上樣緩沖液配制樣品，100℃加熱3 min變性。用去離子水洗滌加樣槽，將凝膠固定于電泳裝置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸電極緩沖液。按預(yù)定順序加樣，加樣量為10～25μl(1.5 mm厚)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用OLYMPUS數(shù)碼照像機(jī)采集圖像。觀察NGF陽性產(chǎn)物在脊髓的分布，分別計(jì)數(shù)各組脊髓內(nèi)、中、外3個(gè)視野1028μm2面積內(nèi)NGF的陽性細(xì)胞數(shù)；測(cè)量陽性產(chǎn)物的平均積分光密度值。各組陽性細(xì)胞數(shù)和平均積分光密度值數(shù)據(jù)以(±s)表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析和LSD組間比較。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)動(dòng)功能 損傷前，3組大鼠BBB評(píng)分均為21.00分。脊髓損傷后，損傷對(duì)照組、電刺激組BBB評(píng)分均小于正常組(P＜0.05)，損傷后第5天起，電刺激組BBB評(píng)分優(yōu)于損傷對(duì)照組(P＜0.05)。見表1。

表1 脊髓損傷后不同時(shí)間點(diǎn)各組大鼠BBB評(píng)分的比較

2.2 免疫組化染色

2.2.1 正常組 NGF免疫反應(yīng)陽性物主要分布于正常大鼠脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元內(nèi)(圖1)，陽性產(chǎn)物的亞細(xì)胞定位主要分布于細(xì)胞核和胞漿。神經(jīng)元突起染色相對(duì)較淺。此外，少量膠質(zhì)細(xì)胞亦見染色。

2.2.2 損傷對(duì)照組 脊髓損傷后1 d，NGF免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)較正常時(shí)增多，但無顯著性差異(P＞0.05)；術(shù)后3d、5 d、7 d時(shí)存在顯著性差異(P＜0.05)。NGF免疫反應(yīng)陽性物主要分布于大鼠脊髓灰質(zhì)前角神經(jīng)元內(nèi)，亞細(xì)胞定位仍是細(xì)胞核和胞漿中，神經(jīng)元突起染色較深(圖2、圖4、圖6、圖8)。

2.2.3 電刺激組 電刺激1 d，NGF免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)較正常組和損傷對(duì)照組增多(圖3)，但無顯著性差異(P＞0.05)。電刺激3d、5 d、7 d，NGF陽性細(xì)胞數(shù)逐漸增加(圖5、圖7、圖9)，電刺激5 d、7 d，免疫陽性細(xì)胞數(shù)較正常組和損傷對(duì)照組同期增多(P＜0.05)。NGF免疫反應(yīng)陽性物主要分布于大鼠灰質(zhì)前角神經(jīng)元內(nèi)，定位于細(xì)胞核和胞漿中，神經(jīng)元突起染色深，少量膠質(zhì)細(xì)胞中NGF免疫反應(yīng)陽性。各組灰質(zhì)前角NGF陽性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)量和平均積分光密度值見表2。

2.3 Western blot檢測(cè) 電刺激組中NGF的表達(dá)比損傷對(duì)照組明顯增多。見圖10。

表2 各組脊髓NGF陽性細(xì)胞數(shù)和平均積分光密度值(n=6)

圖1 正常組(NGF免疫組化染色，400×)

圖2 損傷對(duì)照組術(shù)后1 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖3 電刺激組術(shù)后1 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖4 損傷對(duì)照組術(shù)后3d(NGF免疫組化染色，400×)

圖5 電刺激組術(shù)后3d(NGF免疫組化染色，400×)

圖6 損傷對(duì)照組術(shù)后5 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖7 電刺激組術(shù)后5 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖8 損傷對(duì)照組術(shù)后7 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖9 電刺激組術(shù)后7 d(NGF免疫組化染色，400×)

圖10 Western blot檢測(cè)

3 討論

脊髓損傷后，提高神經(jīng)元的存活質(zhì)量、促進(jìn)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)及定向致靶是恢復(fù)脊髓功能的關(guān)鍵；而受損神經(jīng)元的存活及軸突的再生受內(nèi)、外環(huán)境多種因素的影響。

NGF作為神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素家族的一員，來源于靶組織，逆向營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元，能促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束與靶器官建立功能聯(lián)系和逆轉(zhuǎn)受損神經(jīng)元的萎縮，并增加神經(jīng)元的存活率，最終使受損神經(jīng)修復(fù)[8]；若得不到NGF的營(yíng)養(yǎng)，近側(cè)段很快退變，神經(jīng)元胞體死亡。因此，NGF被認(rèn)為是神經(jīng)再生修復(fù)的重要因子之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，NGF分泌增加，對(duì)維持損傷部位神經(jīng)元的存活及引導(dǎo)神經(jīng)纖維再生具有重要意義。但在沒有外界干預(yù)的情況下，中重度損傷內(nèi)源性NGF表達(dá)量不足以起到保護(hù)和修復(fù)的作用，且維持時(shí)間較短[9]。許多學(xué)者通過給予外源性NGF、移植NGF基因修飾后的施萬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞來增加損傷局部的NGF的濃度[10]，取得一定的治療效果。

本實(shí)驗(yàn)采用術(shù)后24 h經(jīng)皮電刺激治療脊髓損傷，正極接T9右側(cè)夾脊穴，負(fù)極接右下肢足三里穴，目的是在損傷區(qū)周圍形成一個(gè)外加電場(chǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷脊髓局部NGF表達(dá)明顯增加。

本實(shí)驗(yàn)BBB評(píng)分顯示，脊髓損傷后，損傷對(duì)照組和電刺激組大鼠BBB評(píng)分值隨時(shí)間的推移而逐漸增高，且電刺激組大鼠BBB評(píng)分在脊髓損傷后5 d、7 d高于損傷對(duì)照組。這表明，電刺激有利于促進(jìn)大鼠后肢功能的恢復(fù)，可能是由于電刺激誘導(dǎo)NGF的大量表達(dá)，減輕脊髓繼發(fā)性損傷而致。研究顯示，脊髓損傷后針刺可促使脊髓Ⅱ板層、背核和備用背根的背根節(jié)(DRG)中NGF和NGF mRNA陽性神經(jīng)元數(shù)量增多，且此效應(yīng)隨時(shí)間增長(zhǎng)而加強(qiáng)[11]。有報(bào)道，NGF在防止脊髓繼發(fā)性損傷的病理過程中起著重要作用，可促進(jìn)脊髓及背根節(jié)的運(yùn)動(dòng)、感覺軸突再生[12]。電針能夠提高NGF在損傷脊髓中的陽性表達(dá)[13]。

NGF表達(dá)增加的機(jī)理可能是：電針使受損傷的脊髓神經(jīng)再生建立新的軸突聯(lián)系，加速神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的傳輸；也可能是電針治療加速脊髓神經(jīng)元和傳導(dǎo)功能的恢復(fù)對(duì)NGF的需求減少[14]。具體原因還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)顯示，電刺激能誘導(dǎo)NGF表達(dá)，促進(jìn)后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。我們推測(cè)，電刺激NGF表達(dá)增加，從而創(chuàng)造有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境。但脊髓損傷是一種復(fù)雜性的損傷，電刺激治療脊髓損傷中NGF表達(dá)的長(zhǎng)期變化有待進(jìn)一步研究。

[1]Sposato V,Parisi V,Manni L.Glaucoma alters the expression of NGF and NGF receptors in visual cortex and geniculate nucleus of rats:effect of eye NGF application[J].Vision Res,2009,49(1):54-63.

[2]Huang F,Dong X,Zhang L.The neuroprotective effects of NGF combined with GM1 on injured spinal cord neurons in vitro[J].Brain Res Bull,2009,79(1):85-88.

[3]Hajebrahimi Z,Mowla SJ,Movahedin M.Gene expression alterations of neurotrophins,their receptors and prohormone convertases in a rat model of spinal cord contusion[J].Neurosci Lett,2008,441(3):261-266.

[4]Paul C,Samdani AF,Betz RR.Grafting of human bone marrow stromal cells into spinal cord injury:a comparison of delivery methods[J].Spine,2009,34(4):328-334.

[5]Yamasaki K,Setoguchi T,Takenouchi T.Stem cell factor prevents neuronal cell apoptosis after acute spinal cord injury[J].Spine,2009,34(4):323-327.

[6]Allen AR.Surgery of experimental lesion of spinal cordequivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column:A preliminary report[J].JAm MedAssoc,1991,57:878-880.

[7]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC,et al.MASCIS evaluation of open field locomotor scores:effete of experience and teamwork on reliability multieenter animal spinal cord injury study[J].J Neurotrauma,1996,13(7):343-359.

[8]Liel DJ,Huang W,Yong W,et al.Regulation of Trk receptor following conunsion of the rut spinal cord[J].Nerol,2001,167(1):15-26.

[9]Widenfalk J,Lundstromer K,Jubran M,et al.Neurotrophic factors and receptors in the immature and adult spinal cord after meehanical injury or kainic acid[J].J Neurosci,2001,21(10):3457-3475.

[10]Tuszynski MH,Grill R,Jones LL,et al.Spontaneous and augmented growth of axons in the primate spinal cord:Effects of local injury and nerve growth factor-secreting cell grafts[J].J Comp Neurol,2002,449(1):88-101.

[11]諶宏鳴,吳良芳,保天然.針刺對(duì)部分去背根貓脊髓和背根節(jié)NGF及mRNA的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2000,16(4):311.

[12]黃純海,王廷華,李群.脊髓全橫斷大鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)及三七皂苷的干預(yù)效應(yīng)[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù),2007,11(41):8276-8279.

[13]李曉寧,宋金柱,蘇志強(qiáng).夾脊電針對(duì)大鼠脊髓損傷后NGF和BDNF表達(dá)的影響[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,39(12):2014-2016.

[14]王新家,孔抗美,葉衛(wèi)蓮,等.針刺影響慢性脊髓損傷大鼠脊髓組織神經(jīng)生長(zhǎng)因子及其受體的表達(dá)[J].中醫(yī)正骨,2005,17(5):6-7.