雷家軍,王 沖

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽(yáng) 110866）

1 植物多倍體的特點(diǎn)及其應(yīng)用

自然界中植物普遍存在多倍體現(xiàn)象，被子植物中約30%～35%是多倍體，其中禾本科植物中70%為多倍體。多倍體是植物最主要的進(jìn)化方式之一。多倍體育種由于其誘變手段較簡(jiǎn)單，育出的品種經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，還可有效克服遠(yuǎn)緣雜交不親和等特點(diǎn)，因此應(yīng)用較為廣泛。植物多倍體的“巨大性”非常明顯[1]。多倍體植株通?；ü诖蠖駥?shí)，花瓣較多，花色變深，莖變粗壯，耐倒伏，葉片變寬厚，適應(yīng)性增強(qiáng)，光合作用增強(qiáng)。目前，美國(guó)、日本等都已通過(guò)人工誘導(dǎo)多倍體手段育成一批具有較高觀賞價(jià)值的花卉品種。到目前為止，許多觀賞植物已人工誘導(dǎo)獲得了多倍體（見(jiàn)表1），部分已在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。

表1 已誘導(dǎo)獲得多倍體的主要觀賞植物科、屬及種類（1980～2010）Table 1 Family,genus and species of main ornamental plants induced polyploid successfully from 1980 to 2010

2 多倍體的誘導(dǎo)

2.1 誘變材料的選擇

離體培養(yǎng)的材料一般是種子、幼苗、生長(zhǎng)點(diǎn)、莖尖、愈傷組織、胚狀體、懸浮細(xì)胞系、小孢子、原生質(zhì)體或單細(xì)胞等，誘變材料選取植株或組織分裂最旺盛的時(shí)期和部位。誘變材料在很大程度上決定著誘變的效率。雷家軍等采用秋水仙素對(duì)草莓種子和莖尖進(jìn)行離體誘導(dǎo)獲得大量加倍株系[45]。李涵等用秋水仙素對(duì)二倍體齒瓣石斛試管叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)獲得了四倍體植株[32]。崔廣榮等用秋水仙素對(duì)蝴蝶蘭試管苗離體葉片進(jìn)行誘變處理獲得了四倍體植株[31]。李秀蘭等通過(guò)秋石斛種子非共生萌發(fā)與原球莖誘導(dǎo)，在原球莖發(fā)育的原胚期，用混合誘變劑獲得了多倍體植株，且未發(fā)現(xiàn)嵌合體[33]。

2.2 誘變劑種類選擇

2.2.1 秋水仙素

自Blackes lee和Avery等用秋水仙素成功誘導(dǎo)出了四倍體曼陀羅以來(lái)，秋水仙素已成為誘導(dǎo)植物多倍體最常用的誘變劑。適宜濃度的秋水仙素能有效阻礙紡綞絲的形成而仍然保持細(xì)胞的活性，但胞質(zhì)不分離而導(dǎo)致染色體數(shù)目加倍。在一定濃度范圍內(nèi)，秋水仙素對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)無(wú)破壞作用，處理一定時(shí)間的細(xì)胞可在藥劑去除后恢復(fù)正常分裂。秋水仙素只有處理細(xì)胞分裂活躍狀態(tài)的組織才可以使分生組織的染色體加倍。

2.2.2 除草劑

秋水仙素誘導(dǎo)加倍最為廣泛，但秋水仙素有劇毒，因此人們一直在嘗試使用其他誘變劑。最近發(fā)現(xiàn)的甲基氨草磷（APM）、戊炔草胺、安磺靈（Oryzalin）、氟樂(lè)靈（Trifluralin）等除草劑在誘導(dǎo)染色體加倍中具有很大的潛力，它們的作用機(jī)理和秋水仙素一樣[46]。黃權(quán)軍等采用4種抗微管物質(zhì)誘導(dǎo)毛新楊2n花粉，結(jié)果表明4種誘變劑均可誘導(dǎo)2n花粉，但戊炔草胺的效果最佳[47]。van Tuyl等用安磺靈取代秋水仙素對(duì)百合屬和尼潤(rùn)屬植物進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)效果較好，可有效代替秋水仙素[22]。Zlesak等用0.086%氟樂(lè)靈對(duì)微型月季多倍體誘導(dǎo)效果最佳[39]。Dhooghe等采用三種誘變劑對(duì)花毛茛進(jìn)行離體多倍體誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)2 μmol·L-1氟樂(lè)靈處理后多倍體誘變率最高，達(dá)27.5%；1 μmol·L-1安磺靈也能得到較高的誘變率；200 μmol·L-1秋水仙素處理后得到23.3%的多倍體植株[38]。由此可知，除草劑與秋水仙素相比，其濃度低、毒性小、效果好，是一種有潛力的染色體加倍誘變劑。

2.2.3 其他輔助劑

在植物多倍體的化學(xué)誘導(dǎo)過(guò)程中，添加二甲基亞砜（DMSO）、甘油等輔助劑對(duì)提高染色體加倍效果有一定作用。二甲基亞砜是較好的滲透劑和增效劑，添加濃度一般為2%～4%。劉亞娟等在秋水仙素誘導(dǎo)新鐵炮百合多倍體的過(guò)程中，添加2%DMSO能顯著提高四倍體的誘導(dǎo)率[48]。Thao等用秋水仙素和安磺靈對(duì)處理二倍體海芋根尖時(shí)，添加1%DMSO得到了大量四倍體和嵌合體植株[5]。

2.3 誘變處理濃度和處理時(shí)間

秋水仙素濃度和處理時(shí)間共同影響染色體加倍效果，通常秋水仙素的有效濃度為0.005%～2.0%，一般范圍在0.01%～1.0%，而以0.2%～0.4%應(yīng)用最廣泛。對(duì)于觀賞植物來(lái)說(shuō)，木本類一般多采用較高濃度（如1.0%～1.5%），草本類多采用低濃度（如0.01%～0.2%）。一般來(lái)說(shuō)，濃度越高，處理時(shí)間就越短；高濃度、長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)誘變材料傷害嚴(yán)重。處理濃度、處理時(shí)間和誘導(dǎo)方法之間是相互關(guān)聯(lián)的。低濃度、長(zhǎng)時(shí)間的處理多采用固體培養(yǎng)基誘導(dǎo)法，而高濃度、短時(shí)間的處理多采用溶液浸漬法。

鄭思鄉(xiāng)等用不同濃度秋水仙素對(duì)三色堇實(shí)生苗處理不同時(shí)間，以0.1%～0.2%秋水仙素處理12～36 h為佳，誘變率可達(dá)到26%，將嵌合體變異株去除頂端優(yōu)勢(shì)促發(fā)大量的分枝或叢生芽，通過(guò)反復(fù)分割可分離出穩(wěn)定的多倍體[44]。張志勝等利用秋水仙素離體誘導(dǎo)紅掌愈傷組織表明，在0.05%～0.10%內(nèi)，低濃度長(zhǎng)時(shí)間處理時(shí)四倍體誘導(dǎo)率高，高濃度短時(shí)間處理其誘導(dǎo)率低[7]。李涵等低濃度（0.02%）短時(shí)間（24 h）誘導(dǎo)非洲菊兩個(gè)品種沒(méi)有得到加倍植株，在0.10%濃度下處理48 h時(shí)，誘變率達(dá)10%～16%[12]。

2.4 離體培養(yǎng)誘導(dǎo)多倍體的方法

2.4.1 組織培養(yǎng)結(jié)合化學(xué)誘變

近年來(lái)，組織培養(yǎng)技術(shù)和化學(xué)誘導(dǎo)法相結(jié)合的離體培養(yǎng)誘導(dǎo)法已成為一種最常用的染色體加倍方法[49]。利用秋水仙素處理組織培養(yǎng)過(guò)程中的叢生芽、原球莖、體細(xì)胞胚、種子萌發(fā)幼苗等是誘導(dǎo)觀賞植物多倍體的有效方法。處理方法是將秋水仙素直接加入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，或先對(duì)植物材料進(jìn)行秋水仙素處理再放到培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，直接處理外植體會(huì)產(chǎn)生較大藥害。目前，秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)離體誘導(dǎo)加倍，已在百合、大巖桐、馬蹄蓮、虞美人等多種花卉上取得成功。

2.4.2 胚乳培養(yǎng)

獲得三倍體的傳統(tǒng)方法是將經(jīng)秋水仙素誘導(dǎo)的四倍體與二倍體雜交，此法過(guò)程較長(zhǎng)且煩瑣。胚乳是天然的三倍體組織，因此，胚乳培養(yǎng)可獲得三倍體植株，如獼猴桃[50]、白桑[51]等。吳清等以紅楊桃成熟干種子為材料，萌發(fā)后剝離胚乳進(jìn)行培養(yǎng)，再生植株多數(shù)為三倍體，其頻率可達(dá)73.7%[52]。胚乳培養(yǎng)目前主要應(yīng)用在果樹(shù)、蔬菜、水果和糧食作物中，花卉中應(yīng)用較少，在生產(chǎn)上應(yīng)用也很少，其難點(diǎn)在于被子植物胚乳離體培養(yǎng)通常很難誘導(dǎo)和分化出苗。此外，胚乳愈傷組織在繼代培養(yǎng)中染色體數(shù)目不穩(wěn)定，再生植株多為非整倍體、混倍體。

2.4.3 原生質(zhì)體融合

原生質(zhì)體融合是把種內(nèi)、種間或?qū)匍g的原生質(zhì)體融合后再誘導(dǎo)分化成再生植株。體細(xì)胞間融合和體-配融合的結(jié)果是分別產(chǎn)生四倍體細(xì)胞和三倍體細(xì)胞，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步培養(yǎng)可形成四倍體和三倍體植株。劉繼紅等用電場(chǎng)誘導(dǎo)融合丹西紅橘和長(zhǎng)壽金柑的葉肉原生質(zhì)體，獲得四倍體再生植株[53]。利用細(xì)胞融合技術(shù)不僅能自體融合單倍體或二倍體花粉，在短期內(nèi)獲得純合四倍體，還能異體融合野生種與栽培種，產(chǎn)生四倍體雜種，快速實(shí)現(xiàn)野生種的優(yōu)良抗性或品質(zhì)基因向栽培種轉(zhuǎn)移。此外，細(xì)胞融合法還可有效克服植物遠(yuǎn)緣雜交障礙。

2.4.4 2n配子法

2n配子即未減數(shù)配子，它是與體細(xì)胞的染色體數(shù)目相同的花粉或卵細(xì)胞。通過(guò)單向多倍化（雙親之一產(chǎn)生2n配子）或雙向多倍化（雙親均能產(chǎn)生2n配子）均能提高雜交后代的倍性水平。2n配子法雖然在馬鈴薯、果樹(shù)、牧草等作物上早已研究，但在花卉方面國(guó)內(nèi)外報(bào)道還很少，目前僅在百合[21]、秋海棠[9]、郁金香[25]、鶴望蘭[43]等花卉上獲得了2n配子。

2.4.5 其他誘導(dǎo)方法

常用的物理方法有溫度激變、電離輻射、機(jī)械創(chuàng)傷、滲透壓改變、超聲波和摘心等，但這些方法誘變率低，因而較少應(yīng)用?；ɑ苤幸言谠录?、蘭花、菊花、大麗花等應(yīng)用輻射進(jìn)行誘變育種，發(fā)現(xiàn)可在花色、花型、株型上出現(xiàn)有利的變異。

3 多倍體的鑒定

3.1 染色體數(shù)目鑒定

根尖染色體數(shù)目鑒定是最直接、最有效的倍性鑒定方法。通常采用常規(guī)壓片法和去壁低滲法進(jìn)行觀察[54]。陳高等考慮到七里香染色體數(shù)目較多、不宜計(jì)數(shù)及壓片過(guò)程中可能出現(xiàn)染色體斷裂、重疊或丟失等，對(duì)處理后出現(xiàn)染色體變動(dòng)的情況做如下處理：二倍體的染色體數(shù)目2n=2x=38±2，四倍體的染色體數(shù)目2n=4x=76±4，即誤差范圍控制在10%以內(nèi)，這樣便于更快速確定倍性[55]。

3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定是最直觀、最簡(jiǎn)單的鑒定法，從幼苗到大苗各期，都可以從形態(tài)上觀察。通常在秋水仙素早期處理過(guò)程中，生長(zhǎng)明顯受到抑制，生根較晚，且根短而粗壯。經(jīng)染色體加倍后的多倍體植株，常表現(xiàn)出植株生長(zhǎng)緩慢、發(fā)育遲緩、物候期晚。崔廣榮等誘導(dǎo)的蝴蝶蘭多倍體苗在形態(tài)上與二倍體差異顯著，普通二倍體植株葉片表面平滑，葉片較薄、松散，根相對(duì)細(xì)長(zhǎng)且數(shù)量較多；秋水仙素誘導(dǎo)的多倍體試管苗，則葉片緊湊、植株變矮，表現(xiàn)出一定的畸形狀態(tài)，葉片上下表面粗糙不平，葉片厚實(shí)，根粗短且數(shù)量相對(duì)較少[31]。鄭寶強(qiáng)等發(fā)現(xiàn)與春石斛二倍體相比，四倍體植株頂芽和側(cè)芽膨大成球狀，假鱗莖變粗，下層葉片多呈畸形，葉寬、短而厚，葉色濃綠，葉表面粗糙，葉脆易折斷[56]。

3.3 生理指標(biāo)鑒定

染色體加倍后，一些生理指標(biāo)如滲透壓、呼吸作用、光合速率、蒸騰速率、同工酶及酶譜變化、糖含量、維生素含量、礦物質(zhì)含量、氨基酸含量等也發(fā)生相應(yīng)變化，可作為間接鑒定植物倍性的依據(jù)。鄭思鄉(xiāng)等發(fā)現(xiàn)，三色堇四倍體植株的凈光合速率、蒸騰速率、氣孔導(dǎo)度均比二倍體植株高，特別是凈光合速率比二倍體高47.8%[44]。王鴻鶴等發(fā)現(xiàn)經(jīng)秋水仙素處理的大巖桐四倍體與二倍體的過(guò)氧化物酶酶譜差異明顯，還發(fā)現(xiàn)多出兩條特征性譜帶[17]。

3.4 細(xì)胞學(xué)鑒定

3.4.1 氣孔、保衛(wèi)細(xì)胞大小和葉綠體數(shù)目

多倍體植株的氣孔和保衛(wèi)細(xì)胞變大、保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)目增多。陳發(fā)棣等觀察發(fā)現(xiàn)多倍體菊花腦的保衛(wèi)細(xì)胞的長(zhǎng)與寬均顯著大于對(duì)照植株，葉綠體數(shù)目也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)對(duì)照植株[13]。閻志紅等采用FDA熒光鑒定法發(fā)現(xiàn)四倍體西瓜的保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目增加，每對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體數(shù)由8個(gè)增加到15個(gè)[57]。

3.4.2 花粉形態(tài)及花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂行為

多倍體較二倍體花粉粒萌發(fā)孔溝數(shù)目增多，花粉粒大小不整齊，敗育花粉粒較多，小孢子母細(xì)胞增大，在減數(shù)分裂中有異常行為。蔣洪恩等發(fā)現(xiàn)二倍體臨猗梨棗和辣椒棗的花粉粒體積較小，多為3個(gè)或2個(gè)萌發(fā)孔溝；四倍體花粉粒體積顯著增大，并出現(xiàn)了一定數(shù)量的4孔溝花粉，同時(shí)存在大量畸形花粉，花粉活力顯著降低[58]。張敩方等發(fā)現(xiàn)四倍體金魚(yú)草花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程與二倍體對(duì)照相比，主要有以下幾點(diǎn)不同：染色體配對(duì)較復(fù)雜；染色體在后期I和后期II的分離過(guò)程中落后染色體多；花粉全部敗育，花開(kāi)放時(shí)花粉全部粘滯在一起，花藥多呈肉質(zhì)化或發(fā)霉?fàn)€掉[41]。

3.5 分子水平鑒定

流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法可迅速測(cè)定細(xì)胞核內(nèi)DNA含量和細(xì)胞核大小，是大量試材快速鑒定倍性的有效方法，此方法僅需1 cm2樣品就可測(cè)定其材料倍性[59]，但其穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性還有待提高。Roberts等用此方法測(cè)定薔薇DNA含量來(lái)判斷加倍植株的倍性水平[40]。此外，原位雜交（GISH、FISH）、RAPD、RFLP等技術(shù)也廣泛應(yīng)用到多倍體來(lái)源及親緣關(guān)系的鑒定中[60]。

4 多倍體誘導(dǎo)中存在的主要問(wèn)題

4.1 嵌合體的篩選

在誘導(dǎo)植物多倍體時(shí)，出現(xiàn)嵌合體是一種較常見(jiàn)現(xiàn)象。近年來(lái)隨著組織培養(yǎng)技術(shù)與多倍體育種技術(shù)相結(jié)合，嵌合體的問(wèn)題正逐步得到解決。李曉艷等對(duì)秋水仙素離體誘導(dǎo)越橘多倍體的根尖染色體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)變異株系多為二倍體和四倍體的嵌合體[61]。嵌合體的變異細(xì)胞往往發(fā)生在L-Ⅰ層或L-II層，或呈扇形突變。產(chǎn)生的變異細(xì)胞往往生活力弱，分裂速度慢；而正常二倍體細(xì)胞生活力強(qiáng)，分裂快，從而淹沒(méi)變異細(xì)胞，表現(xiàn)為回復(fù)突變。李涵等對(duì)齒瓣石斛的變異植株，采用不定芽技術(shù)結(jié)合組織培養(yǎng)，通過(guò)不斷切割多倍體莖、葉等材料，再培養(yǎng)產(chǎn)生新的個(gè)體，純化為完全多倍體，通過(guò)該方法已得到了部分相對(duì)穩(wěn)定的植株材料[32]。

4.2 多倍體的低稔性

盡管多倍體具有較多優(yōu)勢(shì)，但由正常開(kāi)花結(jié)實(shí)的二倍體加倍成四倍體后，其稔性明顯降低，結(jié)實(shí)性很差，種間雜種五倍體加倍成十倍體后則稔性明顯提高。目前，多倍體有性生殖的遺傳機(jī)理仍不十分清楚，人們一直在運(yùn)用遺傳學(xué)、胚胎學(xué)和分子生物學(xué)等手段探明多倍性植株結(jié)實(shí)率低和種子不飽滿的機(jī)理。譚素英等以西瓜四倍體和二倍體為試材，從授粉受精和胚胎發(fā)育的角度研究認(rèn)為，花粉萌發(fā)率低、胚囊受精率低、胚乳過(guò)早解體、大多數(shù)胚在發(fā)育過(guò)程中敗育是造成低稔性的原因[62]。很多試驗(yàn)證明，增施磷、鉀、鎂、硼等肥料可促進(jìn)同化物質(zhì)的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而提高稔性。

*本文為特邀專家綜述。

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