周寶利姜春云陳志霞李騰飛宋巖

（沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，遼寧沈陽 110161）

茄子黃萎病（Verticillium dahliae）又稱半邊瘋、黑心病、凋萎病，是茄子（Solanum melongenaL.）的重要病害（王建平 等，2011），世界各地都有發(fā)生。茄子黃萎病是由大麗輪枝菌（VerticilliumdahliaeKleb）引起的世界性土傳病害，生產(chǎn)中由于保護地連作、施肥等原因使黃萎病逐年加重，極大地影響了茄子的產(chǎn)量和品質(zhì)（張淑紅 等，2009）。據(jù)記載，該病曾在歐洲、北美和亞洲的一些地區(qū)造成60%～80%的損失（宋敏麗，2006；李明遠，2007），而國內(nèi)隨著蔬菜專業(yè)化生產(chǎn)和設施栽培的發(fā)展，茄子連作栽培越來越普遍，致使茄子黃萎病逐年加重，危害輕者減產(chǎn)30%～40%，重者絕收（Meyer et al.，1994；王茹華 等，2005；張淑紅 等，2006a）。植物是生物活性物質(zhì)的天然寶庫，其產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過40多萬種，其中的一些化學物質(zhì)具有殺蟲、殺菌效果（Einhellig，1996）。自20世紀70年代以來，國內(nèi)外很多學者在該領域，尤其是對病菌有抑制活性的植物提取物方面進行了很多有益的探索（Schutt & Netzly，1991；方哲 等，2008；尹曉東 等，2008；周寶利 等，2010）。Wilkins等報道有1389種植物有可能作為殺菌劑的原材料（Swain，1977）。張淑紅等（2006b）研究了54種天然植物乙醇提取液對茄子黃萎病菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)有15種植物提取物對茄子黃萎病菌菌絲生長抑制率大于50%。植物提取物，如：原白頭翁〔Pulsatilla chinensis（Bunge）Rege〕提取液對小麥赤霉菌（Fusarium graminearumSchw.）菌絲有較強的抑制率（吳恭謙 等，1989），丁香〔Syzygium aromaticum（L.）Merr. Et Perry〕和細辛（Herbaasari）的提取物對番茄灰霉病菌有較強的抑制作用（王樹桐 等，2003）。因此，本試驗以茄子黃萎病為研究對象，用細辛提取物灌根處理茄子植株，研究其對茄子黃萎病的抗病防治效果、植株生長狀況及抗性生理指標的影響，從而篩選出最佳的施用濃度，探討利用細辛提取物抗黃萎病的可能性，為進一步開發(fā)植物源農(nóng)藥奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試茄子品種為西安綠茄，由沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院提供。供試中藥細辛購于沈陽農(nóng)業(yè)大學醫(yī)院。供試茄子黃萎病菌從沈陽農(nóng)業(yè)大學植保學院獲得，按照柯赫氏法則（Koch’s postulate）對其進行分離鑒定，在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫繼代培養(yǎng)。試驗于2011年在沈陽農(nóng)業(yè)大學蔬菜栽培生理與生態(tài)實驗室和10號溫室內(nèi)進行。

1.2 材料提取和溶液制備

采用超聲波提取法（UAE）（Willamson & Richardson，1988；張淑紅 等，2006a），將細辛在陰處陰干，粉碎過40目篩（孔徑0.37 mm）后與80%乙醇按1∶5（m∶V）的比例混合，在KQ2500DB型數(shù)控超聲波清洗器中超聲振蕩提取30 min，離心（8000 r·min-1）20 min，取上清液，在室溫下采用 EYELAN-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空儀濃縮，最后用 50%乙醇定容，藥液毫升數(shù)與植物克數(shù)相等，得到的植物提取物母液濃度為1 g·mL-1，貯存于4 ℃冰箱備用。

1.3 田間預防試驗

試驗于 2011年在沈陽農(nóng)業(yè)大學蔬菜基地日光溫室內(nèi)進行，2月 27日播種西安綠茄，3月27日分苗，定植于13 cm×12 cm的育苗缽中，栽培基質(zhì)為營養(yǎng)基質(zhì)∶草炭=3V∶1V，每缽1株，常規(guī)栽培管理。當幼苗長到四葉一心時，選取長勢一致的幼苗，用濃度分別為1、2、4、8、10 g·L-1的細辛提取物進行灌根處理，每株50 mL，處理4次，每次間隔3 d，以澆灌相同體積的清水為對照。于最后一次處理后第 3天對植株采用傷根法接種黃萎病菌，孢子懸浮液的濃度為1×107個·L-1，每株接種50 mL。次日以相同方式重復接菌。于接菌后第4天開始調(diào)查發(fā)病情況，每隔5 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查5次，待對照發(fā)病較嚴重時，計算發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果。每處理20株，隨機排列，3次重復。

1.4 田間治療試驗

當幼苗長到四葉一心時，選取長勢一致的幼苗進行接菌，接菌方法和預防處理相同。接菌后第3天分別用不同濃度細辛提取物進行灌根處理，每株50 mL，處理4次，每次間隔3 d，以澆灌相同體積的清水為對照。于接菌后第4天開始調(diào)查發(fā)病情況，每隔5 d調(diào)查1次，連續(xù)調(diào)查5次，待對照發(fā)病較嚴重時，計算發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果。每處理 20株，隨機排列，3次重復。

茄子黃萎病病情分級標準（張淑紅 等，2009）：0級，無病株；1級，全株黃化萎蔫葉片少于1/4；2級，全株黃化萎蔫葉片占1/4～1/2；3級，全株黃化萎蔫葉片占1/2～3/4；4級，全株黃化萎蔫葉片達到3/4以上至全部萎蔫枯死。

式中：CK為空白對照病情指數(shù)；PT為細辛提取物處理病情指數(shù)。

1.5 細辛提取物處理對茄子根際土壤中黃萎病菌的田間抑制試驗

通過對茄子植株發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果的調(diào)查，可以得出細辛提取物預防處理茄子幼苗的效果明顯比治療處理的效果好，因此后續(xù)的試驗均以預防處理的茄子幼苗為研究對象。

當幼苗長到四葉一心時，選取長勢一致的幼苗，用上述濃度的細辛提取物分別進行灌根處理，每株50 mL，處理4次，每次間隔3 d，以澆灌相同體積的清水為對照。于最后一次處理后第3天對植株采用傷根法接種黃萎病菌。于接菌后第4天開始檢測根際土壤中黃萎病菌數(shù)量的變化，每5 d檢測1次，連續(xù)檢測4次，每處理20株，隨機排列，3次重復。檢測方法采用水篩法（周寶利 等，2012）：稱取5 g土樣，溶于裝有200 mL水的三角瓶中，靜置20 min后，充分搖動5 min，并在自來水下用38～200 μm篩網(wǎng)過篩，將留在38 μm篩網(wǎng)上的土壤殘留物全部轉(zhuǎn)移到小三角瓶中，用蒸餾水定容為40 mL。接5 皿，每皿用液移槍分別移取2 mL展布于培養(yǎng)基表面（每皿相對接種量為0.25 g），置于超凈工作臺上自然風干，25 ℃培養(yǎng)21 d，取出培養(yǎng)皿后在自來水下用毛刷輕輕刷掉培養(yǎng)基表面的土粒，在雙目解剖鏡下統(tǒng)計培養(yǎng)基上黃萎病菌微菌核萌發(fā)形成的菌落數(shù)。

1.6 生長指標測定

當幼苗長到四葉一心時，選取長勢一致的幼苗，于接菌后第6天開始調(diào)查植株的生長狀況。利用卷尺測定株高（莖基部到莖尖生長點的距離）；利用游標卡尺測量莖粗（子葉節(jié)上方約1 mm處莖的直徑）；利用分析天平測定地上部、地下部鮮質(zhì)量。

1.7 抗性生理指標測定

當幼苗長到四葉一心時，選取長勢一致的幼苗，于接菌后第6天開始測定抗性生理指標。細胞膜相對透性（相對電導率）測定采用外滲電導法（郝建學和劉延吉，2001）；葉綠素含量測定采用丙酮和無水乙醇等體積比的混合浸提液黑暗浸提法（郝建軍和劉延吉，2001）；根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑（TTC）法（李合生，2002）。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性測定采用苯丙氨酸脫氨顯色法（張志安和陳展宇，2008）；過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚染色法（劉萍和李明軍，2007）；超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用NBT染色法（郝建軍和劉延吉，2001）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

應用Microsoft Excel 2007和DPS軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 細辛提取物對茄子幼苗黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果的影響

從表1可以看出，在預防處理和治療處理中，1～10 g·L-1細辛提取物處理的茄子幼苗黃萎病發(fā)病率及病情指數(shù)均顯著低于對照，表現(xiàn)出不同程度的抗病性，而且預防處理的發(fā)病率及病情指數(shù)都比治療處理的低；其中4 g·L-1預防處理的茄子抗病性最強，發(fā)病率僅為14.24，病情指數(shù)為5.32，防治效果達到86.26%。

表1 細辛提取物對茄子幼苗黃萎病發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果的影響

2.2 細辛提取物對茄子幼苗根際土壤中黃萎病菌的抑制作用

從表 2可以看出，總體上，施加細辛提取物顯著降低了茄子根際土壤中黃萎病菌的數(shù)量。隨著植株的生長，施加細辛提取物處理的植株根際土壤中黃萎病菌數(shù)量在各個時期均明顯低于對照，其中4 g·L-1處理的抑制作用優(yōu)于其他處理濃度。在施加4 g·L-1細辛提取物時，茄子根際土壤中黃萎病菌的數(shù)量在各個時期與對照相比分別降低了 59.38%、62.79%、60.79%、60.06%。

表2 細辛提取物對茄子幼苗根際土壤中黃萎病菌的抑制作用

表3 細辛提取物對茄子幼苗生長的影響

表4 細辛提取物對茄子幼苗相對電導率、葉綠素含量、根系活力的影響

2.3 細辛提取物對茄子幼苗生長的影響

如表3所示，與對照相比，不同濃度細辛提取物處理的茄子幼苗株高、莖粗、地上部鮮質(zhì)量、地下部鮮質(zhì)量均表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。隨著細辛提取物濃度的增大，其對茄子幼苗各生長指標的優(yōu)勢作用呈先升高后降低的變化趨勢。當細辛提取物濃度為4 g·L-1時，生長優(yōu)勢表現(xiàn)的最為明顯，株高較對照增加了 10.35%，莖粗增加了 13.00%，地上部鮮質(zhì)量增加了13.36%，地下部鮮質(zhì)量增加了2.36%。除了濃度為1 g·L-1時地下部鮮質(zhì)量與對照無顯著差異外，其他各處理均顯著高于對照。

2.4 細辛提取物對茄子幼苗抗性生理指標的影響

2.4.1 細辛提取物對茄子幼苗相對電導率、葉綠素含量、根系活力的影響 由表4可見，隨著細辛提取物濃度的增加，茄子幼苗相對電導率表現(xiàn)出先降低再升高的變化趨勢，與發(fā)病率呈正相關。當細辛提取物濃度為4 g·L-1時茄子幼苗相對電導率最低，為 13.03%，較對照降低 46.44%。各處理葉綠素含量、根系活力呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。當細辛提取物濃度為4 g·L-1時，茄子幼苗葉綠素含量最高，較對照提高了74.92%；根系活力最強，較對照提高了238.95%，且各處理與對照相比差異均達顯著水平。

2.4.2 細辛提取物對茄子幼苗保護酶（PAL、POD、SOD）活性的影響 如表 5所示，與對照相比，不同濃度的細辛提取物處理均能極顯著的提高茄子幼苗葉片PAL、POD、SOD的活性；隨著細辛提取物濃度的增大，茄子幼苗葉片的PAL、POD和 SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，其峰值均出現(xiàn)在4 g·L-1時，較對照分別增加了295.57%、214.21%和53.92%；且各濃度處理的保護酶活性均極顯著的高于對照。

表5 細辛提取物對茄子幼苗保護酶活性的影響

3 結論與討論

眾多研究表明，細辛具有抑制植物病原菌的活性。李少華（2011）在細辛對番茄早疫病菌的抑制作用及其活性成分的分離試驗中得出，細辛對植物病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有不同程度的抑菌活性。張國珍等（1995）研究表明，細辛揮發(fā)油對Alternaria panax、Phytophthora cactorum、Rhizoctonia solani、Fusarium solani、Ustilago coicis等真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有一定的抑制作用。王樹桐等（2004）在植物提取物對番茄灰霉病菌的抗菌活性室內(nèi)篩選試驗中，發(fā)現(xiàn)細辛提取物在很低濃度下對番茄灰霉病菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)都具有極強的抑制作用。黃奔立等（2006）發(fā)現(xiàn)細辛浸提液對辣椒疫病菌、番茄灰霉病菌、茄黃萎病菌、黃瓜枯萎病菌和黃瓜菌核病菌有明顯抑制作用。張淑紅等（2006a）測定了天然植物提取物對茄子黃萎病菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)細辛提取物中存在抑制黃萎病菌的活性物質(zhì)。

本試驗結果也證明了細辛提取物對茄子黃萎病菌表現(xiàn)出很強的抑制作用。4 g·L-1細辛提取物預防處理對茄子黃萎病的防治效果最好，達到了86.26%，并且顯著降低了根際土壤中黃萎病菌的數(shù)量。隨著細辛提取物濃度的增加，茄子幼苗的株高和莖粗呈先增高再降低的變化趨勢，且都顯著高于對照，可見低濃度細辛提取物預防黃萎病發(fā)生的作用力強，從而抑制了由黃萎病對植株生長產(chǎn)生的不利影響，而高濃度的細辛提取物的抑制作用減弱。隨著細辛提取物濃度的增加，茄子幼苗的相對電導率呈先降低再升高的變化趨勢，與發(fā)病率呈正相關；當濃度為4 g·L-1時相對電導率最低，為 13.03%，較對照降低 46.44%。細辛提取物濃度在 0～4 g·L-1范圍時，茄子幼苗的葉綠素含量及根系活力均隨著濃度的增加而增加，濃度為 4 g·L-1時葉綠素含量最高，為1.569 mg·L-1，且根系活力也最強，達到了11.27 μg·L-1·min-1，較對照增強了238.95%；濃度為8、10 g·L-1時葉綠素含量及根系活力有所下降，但都極顯著高于對照。這些均為細辛提取物增強茄子植株抗性、預防感病的重要體現(xiàn)。

近年來，細胞保護酶系統(tǒng)與植物抗病性的關系受到人們的普遍關注?？讘c科等（2001）對不同茄子品種接種黃萎病菌后的SOD、POD、PAL活性進行了測定，結果表明SOD、POD、PAL活性上升，而且抗病品種酶活性上升的較快。許多植物感病后，其體內(nèi)保護酶活性的變化與植株抗病性呈正相關（張樹生 等，2006）。本試驗結果顯示，不同濃度的細辛提取物均可提高茄子幼苗PAL、POD和SOD的活性，說明細辛提取物處理具有調(diào)節(jié)植株保護性酶系統(tǒng)平衡的功能，清除自由基功能增強，減小膜損傷程度，即防御酶活性增強，進而提高了茄子幼苗的抗病性；其中以4 g·L-1細辛提取物處理的茄子幼苗保護酶活性最高，PAL、POD和SOD的活性較對照分別提高了295.57%、214.21%和53.92%，抗病性最強，與田間抗病試驗所得結果相同。

綜上所述，細辛提取物處理抑制了茄子黃萎病的發(fā)生，降低了病情指數(shù)，促進了茄子植株的生長，提高了細胞保護酶的活性，從而增強了茄子植株的抗病性。隨著細辛抑菌有效成分作用機理研究的逐步深入，人們對其認識和利用程度也必將上升到新的臺階。因此，以細辛作為植物病蟲害有效的防治手段在無公害蔬菜生產(chǎn)中具有重要的意義和廣闊的前景。

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