丘漫宇張素平郭爽李伯壽劉玉平

（廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，廣東廣州 510308）

番茄（Lycopersicon esculentumMill.）是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的蔬菜種類之一，在我國也是一種重要的蔬菜作物，因其富含多種維生素、糖類、番茄紅素和胡蘿卜素而廣受歡迎（劉仲齊等，2004）。目前市場上廣泛栽培的番茄品種大多為雜交種。在雜交種選育過程中，種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系是作為親本選擇和雜交配組的主要依據(jù)。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的成熟和發(fā)展，其在鑒定蔬菜種質(zhì)材料親緣關(guān)系中的優(yōu)勢越來越明顯，SSR標(biāo)記以其多態(tài)性豐富、重復(fù)性好、信息量大和PCR技術(shù)方便等優(yōu)勢（艾呈祥 等，2005），正被廣泛的應(yīng)用于蔬菜遺傳多樣性的應(yīng)用研究中。

本試驗旨在利用 SSR分子標(biāo)記技術(shù)對現(xiàn)有的番茄高代自交系進行親緣關(guān)系分析，劃分雜種優(yōu)勢群，為今后利用雜交優(yōu)勢育種提供理論依據(jù)。同時對已育成的番茄品種金豐1號、年豐、益豐的親本進行遺傳距離測定，初步探討親本的分子標(biāo)記遺傳差異與雜種優(yōu)勢的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗共選擇了20份番茄育種材料（表1），其中 No.1、No.2、No.3、No.5、No.6、No.8和No.9是自封頂類型，其余13份材料為無限生長類型，No.18是長貨架材料。No.3和No.4是雜交一代番茄品種金豐1號的父本和母本，No.5和No.8是雜交一代番茄品種年豐的父本和母本，No.6和No.7是雜交一代番茄品種益豐的父本和母本。2011年8月12日在溫室播種，9月8日定植大棚，每份材料定植20株，待幼苗長至6～7片真葉時混株取3～4片嫩葉于離心管中，-20 ℃保存，以備提取DNA。

1.2 試驗方法

根據(jù)Suliman-Pollatschek等（2002）的方法及SGN數(shù)據(jù)庫（http://www.sgn.cornell.edu）的數(shù)據(jù)，選取25對在番茄中可能具有多態(tài)性的SSR標(biāo)記，對20份番茄高代自交系育種材料（表1）進行親緣關(guān)系分析，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.1 DNA提取及檢測 采用改良的CTAB法（Clark，1998）提取番茄葉片總DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA條帶完整性，采用UV9100B型紫外可見分光光度計測定其吸光度值，檢測純度和濃度，并稀釋為20 ng·μL-1，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴增 擴增反應(yīng)在Thermo PX2 PCR儀上進行，反應(yīng)體系25 μL，包括10×PCR buffer 2.5 μL、1.6 mmol·L-1MgCl21.5 μL、0.2 μmol·L-1dNTP 2 μL、0.36 μmol·L-1Primer 正反向各 1 μL、2.5 UTaq酶 0.2 μL、20 ng模板 DNA 1 μL、ddH2O 15.8 μL。PCR 反應(yīng)過程：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%變性聚丙稀酰胺凝膠上電泳，銀染檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 在擴增產(chǎn)物電泳圖譜中的同一遷移位置上，有擴增條帶的記為1，無擴增條帶的記為0，得到各樣品帶型分布表。采用POPGEN32軟件計算多態(tài)位點百分率P（%）、相似系數(shù)和遺傳距離（GD），并用MTSUS2.11版軟件的非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進行系統(tǒng)聚類分析，構(gòu)建分子進化系統(tǒng)樹。

表1 20份番茄材料的編號及類型

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性分析

利用25對SSR引物對20份番茄材料進行SSR分子鑒定。結(jié)果表明，有21對引物可以在番茄材料上擴增出條帶，18對引物具有多態(tài)性，引物7的SSR擴增結(jié)果如圖1所示。從21對引物的擴增結(jié)果中共統(tǒng)計到66條清晰可辨的條帶，其中多態(tài)性條帶為52條，多態(tài)率為78.8%，譜帶大小為100～1000 bp。最少的可擴增出1條條帶，最多的可擴增出6條條帶，平均每對引物可擴增出3.1條條帶，其中引物10擴增出的多態(tài)性譜帶最多。

圖1 引物7對20份番茄材料的SSR擴增圖譜

2.2 遺傳距離分析

遺傳距離是衡量樣品間相似性程度的度量，遺傳距離數(shù)值越大表明材料間的差異越明顯。采用UPGMA法對SSR擴增結(jié)果進行遺傳距離計算，結(jié)果表明20份番茄材料兩兩間的遺傳距離（GD）在1.4892～9.1806之間，遺傳距離大于7的育種材料有18份，其中No.1與No.15之間的遺傳距離最大，為9.1806，表明這些材料間的遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠，可以據(jù)此指導(dǎo)田間的育種實踐，減少親本選擇和雜交配組的盲目性。

No.3與No.4為金豐1號的父本和母本，遺傳距離為2.6817；No.5與No.8為年豐的父本和母本，遺傳距離為3.2052；No.6與No.7為益豐的父本和母本，遺傳距離為7.1931。在生產(chǎn)實際中，益豐的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病性等田間表現(xiàn)均明顯優(yōu)于金豐1號和年豐?？梢?，這3個番茄品種的田間表現(xiàn)與其親緣關(guān)系的分子檢測結(jié)果一致，即親緣關(guān)系越遠，雜種優(yōu)勢越明顯。

2.3 聚類分析

圖2 20份番茄材料SSR標(biāo)記的聚類分析圖

從SSR標(biāo)記的遺傳聚類分析圖可以看出（圖2），以遺傳相似系數(shù)0.67為標(biāo)準(zhǔn)可將20份番茄育種材料劃分為4大類，第1類共有13份材料，包括6份自封頂類型和7份無限生長類型；第2類共有4份材料，均為無限生長類型；第3類有2份材料，1份為自封頂類型，1份為無限生長類型；第4類只有No.181份材料，為無限生長類型的長貨架材料，與其余19份番茄材料的遺傳距離介于4.5153～7.6303之間，表明長貨架材料的遺傳背景較常規(guī)番茄育種材料的遺傳差異較大，育種實踐中可以考慮引入長貨架育種材料來改善番茄育種材料的結(jié)構(gòu)，突破目前遺傳基礎(chǔ)趨于狹窄的局限。金豐1號和年豐的父母本均聚在了第1類，表明它們之間的遺傳相似系數(shù)較大，親緣關(guān)系較近；益豐的父本和母本遺傳距離較遠，分別聚在了第1類和第3類。

3 結(jié)論與討論

雜種優(yōu)勢的強弱取決于雙親性狀間的互補性，在一定范圍內(nèi)，雙親的基因差異越大，親緣關(guān)系越遠，雜種優(yōu)勢就越明顯。遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析是番茄遺傳育種研究的重要內(nèi)容，有利于雜種優(yōu)勢群的劃分，在育種實踐中指導(dǎo)親本的選擇和選配。而DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究提供了新的手段和方法（金鳳媚 等，2004）。在番茄遺傳多樣性研究中，趙凌俠等（2002）用RAPD分子標(biāo)記對番茄屬9個種的43份材料進行了遺傳多樣性分析，將43份材料分為4個類群。姚祝平等（2010）利用AFLP分子標(biāo)記對44份番茄材料進行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，從64對引物組合中篩選出15對用于擴增，共獲得364條多態(tài)性條帶，將44份番茄材料分成5個復(fù)合組和1個獨立組。

本試驗選用了在育種實踐中用于配制雜交組合或?qū)⒂糜谂渲平M合的 20份高代純系番茄育種材料作為供試材料，意在將田間育種實踐與實驗室理論分析相結(jié)合，有針對性的分析育種材料之間的遺傳距離，明確這些育種材料間的親緣關(guān)系，一方面為田間育種實踐提供理論依據(jù)和參考，另一方面為實驗室理論分析尋找田間實證。從這些材料中選擇遺傳距離較大的材料進行雜交組合，在一定程度上可以減少田間親本選擇和雜交配組的盲目性。

本試驗的聚類分析結(jié)果中，并沒有將生長類型相同的材料全部劃分為一類，而是在各類群間交叉出現(xiàn)，這可能是由于以下兩方面原因造成的：首先，由于供試材料均為高代自交系育種材料，材料之間經(jīng)過了多代的雜交和回交，難免會出現(xiàn)遺傳背景的交叉；其次，生長類型只是其所有性狀的一個組成部分，并不能代表所有基因組的組成，同時并沒有針對生長類型進行引物的特異選擇，從而無法將不同的生長類型完全區(qū)分開，因此出現(xiàn)交叉現(xiàn)象。所以，在今后的親緣關(guān)系分析中，在引物的選擇方面，可以考慮針對特定的某幾個目標(biāo)性狀，選擇針對性較強的引物進行遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。

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