謝利霞，呂 昌，葉 玲，唐 斕（1.廣東醫(yī)學(xué)院附屬南山醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 51805；.南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515）

烏頭堿（Aconitine，AC）具有祛寒、止痛等功效，為中醫(yī)和民間常用中草藥。其毒性成分主要損害神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，表現(xiàn)為各種類型的心律失常[1]。目前國(guó)內(nèi)、外學(xué)者已對(duì)AC類物質(zhì)的毒性機(jī)制進(jìn)行了有益探索，如Murayama M等[2]探索了AC類物質(zhì)的抗炎作用和毒性大小，Xiao K等[3]研究了AC體外對(duì)受孕大鼠的胎盤毒性，結(jié)果均顯示AC有直接的毒性作用。筆者采用小鼠醋酸扭體法和毒性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)測(cè)定得單體AC的安全范圍是0.068 79～0.087 08 mg·kg-1（ED95～LD5），安全范圍相當(dāng)窄。這種高毒性和狹窄的治療范圍與AC在體內(nèi)的代謝相關(guān)。研究表明，AC可被人體重要的Ⅰ相藥物代謝酶系統(tǒng)——細(xì)胞色素P450氧化酶（CYP450）系所代謝，生成毒性和藥理活性改變的多個(gè)代謝產(chǎn)物，參與體內(nèi)作用[4～6]。但目前僅對(duì)AC的代謝轉(zhuǎn)化途徑和代謝產(chǎn)物在大鼠和人的尿液及肝微粒體中進(jìn)行過(guò)研究，藥物與CYP450的相互作用是藥物產(chǎn)生治療作用和（或）毒性反應(yīng)的關(guān)鍵因素。筆者選擇豚鼠和小鼠肝微粒體在體外研究AC在不同種屬中的代謝特征，并采用超高效液相色譜-多級(jí)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法測(cè)定AC在2個(gè)種屬肝微粒體孵育樣品中的代謝產(chǎn)物，分析比較AC代謝轉(zhuǎn)化途徑和產(chǎn)物生成的種屬差異，以期為AC的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters Micromass高分辨質(zhì)譜（HRMS）儀、AcquityTM高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Waters公司）；恒溫水浴箱（上海福碼實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超純水制備系統(tǒng)（美國(guó)Millpore公司）；NI-2RC渦旋儀（美國(guó)熱電儀器公司）；5423高速離心機(jī)、移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）。

1.2 試藥

AC（美國(guó)LC Laboratories）公司；雙嘧達(dá)莫（美國(guó)Sigma Aldrich公司）；小鼠和豚鼠肝微粒體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氯化鎂溶液（NADP，glucose-6-phosphate and magnesium chlo-ride，以下簡(jiǎn)稱溶液A）、6-磷酸葡萄糖脫氫酶枸櫞酸鈉溶液（glucose-6-phosphate dehydrogenase in sodium citrate，以下簡(jiǎn)稱溶液B）均購(gòu)于美國(guó)BD公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 AC供試品母液的制備

精密稱取AC 12.93 mg，置于1.5 mL離心管中，精密吸取200μL二甲基亞砜（DMSO）加入離心管，超聲溶解后精密吸取乙腈800μL加入離心管，渦旋混勻。即制備20 mmol·L-1的AC供試品母液，于－20℃貯藏，備用。

2.2 AC在體外肝微粒體Ⅰ相代謝體系的建立

（1）肝微粒體酶（20μL，10 mg·mL－1）的終濃度控制在約0.4 mg·mL－1，反應(yīng)體系加入溶液A 50 μL和溶液B 10 μL，整個(gè)體系在50 mmol·L－1的PBS溶液中（pH 7.4）。（2）上述混合物置于37℃水浴培養(yǎng)5 min后加入AC供試品母液（20μL，終濃度控制在10μmol·L－1，DMSO終濃度為0.2%），混合均勻；上述混合物（整個(gè)體系總體積約為1 000μL）置于37℃水浴培養(yǎng)至30～120 min。（3）將反應(yīng)系統(tǒng)移入冰浴終止反應(yīng)，加入50 μmol·L－1雙嘧達(dá)莫（100%乙腈溶解）50 μL為內(nèi)標(biāo)，加入二氯甲烷4 mL，渦旋30 s，樣品離心（3 500 r·min－1）15 min，取出上清液即蛋白層后將二氯甲烷層轉(zhuǎn)移到另一干凈玻璃管中以氮?dú)獯蹈?，加入?乙腈（1∶1）110 μL復(fù)溶后離心（13 000 r·min－1）15 min，取上清液供UPLC-MS/MS和HPLC-HRMS分析用。

2.3 UPLC-MS/MS和HPLC-HRMS法鑒定ACⅠ相代謝產(chǎn)物方法

2.3.1 UPLC-MS/MS鑒定ACⅠ相代謝產(chǎn)物方法 （1）UPLC條件：流動(dòng)相A為0.05%醋酸銨水溶液，流動(dòng)相B為乙腈溶液（梯度洗脫：0～12 min，90%A～55%A；12～22 min，35%A；22～26 min，0%A；26～30 min，0%A；30～30.1 min，90%A；30～33 min，90%A），流速為0.35 mL·min－1，柱溫為常溫。（2）MS條件：離子源為ESI+，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，錐孔電壓為35 V，離子源溫度為110℃，干燥氣（氮?dú)猓囟葹?00℃。

2.3.2 HPLC-HRMS法鑒定ACⅠ相代謝產(chǎn)物方法 （1）HPLC條件：流動(dòng)相A為0.05%醋酸銨水溶液，流動(dòng)相B為乙腈溶液（梯度洗脫：0～12 min，90%A～55%A；12～22 min，35%A；22～26 min，0%A；26～30 min，0%A；30～30.1 min，90%A；30～33 min，90%A），流速為0.35 mL·min－1，柱溫為常溫。（2）HRMS條件：離子源為ESI，正離子全掃描方式；毛細(xì)管電壓為4 500 V，霧化氣壓為1.5 bar（1 bar＝0.1 MPa），干燥氣溫度為200 ℃，氮?dú)饬魉贋?.0 mL·min－1。

2.4 AC在肝微粒體中代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定

2.4.1 AC的裂解規(guī)律 AC結(jié)構(gòu)中有3個(gè)羥基，分別在C3、C13和C15位；有4個(gè)甲氧基，分別在C1、C6、C16和C18位，C8位取代基為乙酰氧基，C14位取代基為苯甲酰氧基。N上連接的基團(tuán)為乙基。這些基團(tuán)都處在AC空間結(jié)構(gòu)的外圍，在電離的過(guò)程中容易失去而產(chǎn)生相應(yīng)的碎片離子。在選定的MSn條件下對(duì)AC進(jìn)行多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析。

[M+H－60]+離子為基峰離子（m/z586），經(jīng)研究證實(shí)，AC結(jié)構(gòu)中C8的乙酰氧基是這個(gè)離子產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。電離過(guò)程中，C8的乙酰氧基和鄰近碳上的氫結(jié)合，形成一分子乙酸，AC準(zhǔn)分子離子丟失質(zhì)量數(shù)為60 Da的乙酸中性碎片后產(chǎn)生了[M+H－60]+離子。Li R等[6]報(bào)道，[M+H－60]+（m/z586）、[M+H－60－32－28]+（m/z526）、[M+H－60－32×3－122]+（m/z368）均為AC的診斷離子。圖1也顯示，這3種診斷離子為AC特有的裂解離子。這將對(duì)其代謝產(chǎn)物的鑒定提供依據(jù)。

2.4.2 代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定 AC在豚鼠和小鼠體外肝微粒體中進(jìn)行Ⅰ相代謝酶孵育后，利用UPLC-MS/MS和HPLCHRMS方法，發(fā)現(xiàn)并確證多個(gè)代謝產(chǎn)物，結(jié)果都相同。

2.4.3 分子量為MW-14的代謝產(chǎn)物：aMD14（[M+H]+m/z632）

AC在肝微粒體中孵育后的UPLC-MS/MS聯(lián)用總離子流圖的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)提取得到2個(gè)m/z632的提取離子流圖。通過(guò)高分辨質(zhì)譜確定他們的元素組成，發(fā)現(xiàn)其分子式為C33H46NO11（表1中M1、M2），所以認(rèn)為其是同分異構(gòu)體。以UPLC-MS/MS對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行MS2研究，同時(shí)參考原型藥物的裂解規(guī)律，對(duì)2個(gè)代謝產(chǎn)物物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步推斷。2個(gè)代謝產(chǎn)物m/z632的二級(jí)質(zhì)譜均含有主要的碎片信息m/z572（圖1中B2、C2），比AC相應(yīng)的碎片離子m/z586低14個(gè)質(zhì)量單位，表明這2個(gè)化合物與AC具有相同的碎片的斷裂方式，證明二萜的化學(xué)骨架結(jié)構(gòu)是完整的。在前文總結(jié)的裂解規(guī)律中提到，對(duì)AC進(jìn)行串聯(lián)，可以發(fā)現(xiàn)MS2譜中基峰離子為m/z586，為丟失乙酸后生成的[M+H－60]+離子。選擇該離子進(jìn)行串聯(lián)，會(huì)產(chǎn)生m/z368的離子[M+H－60－（32×3）－122]+。筆者認(rèn)為[M+H－60]+離子進(jìn)一步裂解，先后脫去C1、C6、C16位甲氧基和C14位的苯甲酰氧基，最終形成m/z368的離子。aMD14類代謝產(chǎn)物均比原型藥物少14Da，AC類物質(zhì)在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中較容易發(fā)生甲氧基的去甲基化反應(yīng)。所以，筆者認(rèn)為這2個(gè)化合物為去甲基化產(chǎn)物。如果是C1、C6或C16位發(fā)生了去甲基化反應(yīng)生成了羥基，由于在裂解的過(guò)程中，這些基團(tuán)會(huì)以水的形式脫去，所以形成的仍然還是m/z368的離子；如果丟失亞甲基的不是上述位置，則發(fā)生了改變的基團(tuán)被保留到最后，最終形成的特征離子的m/z應(yīng)該是354（368－14）。根據(jù)這個(gè)規(guī)律，筆者初步分析去甲基化反應(yīng)發(fā)生的位置在C1、C6或C16位。研究結(jié)果顯示，M2的相對(duì)豐度高于M1，考慮電子效應(yīng)和空間位阻及參照拉巴烏頭堿的代謝規(guī)律[7]，16位甲氧基最易脫掉甲基，因此具有較高豐度且保留時(shí)間為2.35 min的M2被鑒定為16-O-去甲基烏頭堿。由于除16位外1、2、18位均含甲氧基且都有可能發(fā)生脫甲基反應(yīng)，故不能確定脫甲基的具體位置。M1鑒定為O-去甲基烏頭堿。質(zhì)譜見(jiàn)圖1。

2.4.4 分子量為MW-28的代謝產(chǎn)物：aMD28（[M+H]+，m/z618） 肝微粒體孵育體系中一共發(fā)現(xiàn)2個(gè)m/z618的色譜峰。通過(guò)高分辨質(zhì)譜確定他們的元素組成，發(fā)現(xiàn)它們的分子式均為C32H44NO11（表1中M3、M4），認(rèn)為它們是同分異構(gòu)體。aMD 28類代謝產(chǎn)物均比原型藥物少28Da，AC類物質(zhì)在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中較容易發(fā)生甲氧基的去甲基化反應(yīng)及N上的去乙基化反應(yīng)。參考原型藥物的裂解規(guī)律，對(duì)2個(gè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推斷，認(rèn)為這2個(gè)化合物中一個(gè)去掉2個(gè)甲基，另一個(gè)N位脫掉1個(gè)乙基。保留時(shí)間為0.96 min的M3有診斷離子m/z558和m/z498，m/z498推測(cè)為m/z558脫掉一分子甲氧基（-OCH3）和1分子乙基（-C2H5），只有N上接-C2H5的化合物才可在電子轟擊中脫去此碎片，因此M3為N位脫乙基產(chǎn)物，而另一化合物M4則為脫2個(gè)甲基的代謝物。質(zhì)譜見(jiàn)圖1。

2.4.5 分子量為MW-2的代謝產(chǎn)物：aMD2（[M+H]+m/z644）肝微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)1個(gè)m/z644的色譜峰。通過(guò)高分辨質(zhì)譜確定它們的元素組成，發(fā)現(xiàn)其元素組成為C34H46NO11（表1中M5），aMD2代謝產(chǎn)物比原型藥物少2Da，所以認(rèn)為此代謝物為AC的脫氫化產(chǎn)物。對(duì)各個(gè)組分進(jìn)行MS2研究，記錄各個(gè)組分的裂解規(guī)律，比較它們之間的相同點(diǎn)和不同點(diǎn)，同時(shí)參考原型藥物的裂解規(guī)律，對(duì)次代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推斷。aMD2的MS2圖出現(xiàn)了典型的診斷離子m/z586，m/z552以及m/z524，則在C15位不可能出現(xiàn)脫氫現(xiàn)象，故代謝產(chǎn)物應(yīng)為3位脫氫產(chǎn)物。質(zhì)譜見(jiàn)圖2。

2.4.6 分子量為MW+16的代謝產(chǎn)物：aMD16（[M+H]+m/z662） 肝微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)2個(gè)m/z662的色譜峰。通過(guò)高分辨質(zhì)譜確定它們的元素組成，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)的元素組成為C34H48NO12（表1中M6），其余為雜質(zhì)，aMp16代謝產(chǎn)物比原型藥物多16 Da，所以認(rèn)為此代謝物為AC的羥化產(chǎn)物。

2.4.7 分子量為MW-16的代謝產(chǎn)物：aMD16（[M+H]+m/z630） 微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)1個(gè)m/z630的色譜峰。通過(guò)高分辨質(zhì)譜確定元素組成為C34H48NO10（表1中M7），aMp16代謝產(chǎn)物比原型藥物少16 Da，所以認(rèn)為此代謝物為AC的脫氧產(chǎn)物。對(duì)其進(jìn)行MS2研究，記錄其裂解規(guī)律，同時(shí)參考原型藥物的裂解規(guī)律，對(duì)此代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步推斷。MS2圖譜中顯示了典型的診斷離子m/z510。推測(cè)其為3位脫氧產(chǎn)物。

2.4.8 分子量為MW-42的代謝產(chǎn)物：aMD42（[M+H]+m/z604） 肝微粒體孵育體系中發(fā)現(xiàn)2個(gè)m/z604的色譜峰。對(duì)其進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜串聯(lián)，在MS2圖中未發(fā)現(xiàn)[M+H－60]+離子，AC的裂解規(guī)律指出，[M+H－60]+離子是由C8位基團(tuán)脫去所產(chǎn)生的，所以代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)中AC有的C8位基團(tuán)一定發(fā)生了改變。AC在水中很不穩(wěn)定，C8位酰鍵極易發(fā)生水解，其水解產(chǎn)物為14-苯甲酰烏頭胺（也稱8-去乙酰烏頭堿），產(chǎn)物與AC相差42 Da，筆者推斷aMD42為AC的水解產(chǎn)物：14-苯甲酰烏頭胺（表1中M8）。質(zhì)譜見(jiàn)圖2。

表1 烏頭堿在豚鼠和小鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物Tab 1 Metabolites of aconitine in liver microsomes of guinea pig and mice

A1.AC 的MS圖；A2.AC[M+H]+(m/z 646)的MS2圖；B1.M1的MS圖；B2.M1[M+H]+(m/z 632)的 MS2圖；C1.M2的MS圖；C2.M2[M+H]+(m/z 632)的MS2圖；D1.M3的MS圖；D2.M3[M+H]+(m/z 618)的MS2圖；E1.M4的MS圖；E2.M4[M+H]+(m/z 618)的MS2圖Fig 1 Mass chromatogramsA1.MS chromatograms of AC；A2.MS2[M+H]+(m/z 646)of AC；B1.MS chromatograms of M1；B2.MS2[M+H]+(m/z 632)of M1；C1.MS chromatograms of M2；C2.MS2[M+H]+(m/z 632)of M2；D1.MS chromatograms of M3；D2.MS2[M+H]+(m/z 618)of M3；E1.MS chromatograms of M4；E2.MS2[M+H]+(m/z 618)of M4

2.5 代謝物小結(jié)

由“2.4”項(xiàng)下分析可知，AC在小鼠和豚鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物一致，都檢測(cè)到了8種代謝產(chǎn)物，其中有2個(gè)脫甲基產(chǎn)物（M1、M2），1個(gè)脫雙甲基產(chǎn)物（M3），1個(gè)脫乙基產(chǎn)物（M4），1個(gè)脫氫產(chǎn)物（M5），1個(gè)羥化產(chǎn)物（M6），1個(gè)脫氧產(chǎn)物（M7）和1個(gè)水解產(chǎn)物（M8）。從結(jié)構(gòu)上看，其代謝規(guī)律以水解、脫甲基、羥化、脫氫代謝為主，而CYP參與了其中最重要的脫甲基、羥化、脫氫代謝（M1～M6）。AC在豚鼠和小鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物見(jiàn)表1；AC在豚鼠和小鼠肝微粒體中可能的代謝途徑見(jiàn)圖3。

3 討論

研究結(jié)果表明，在小鼠和豚鼠肝微粒體代謝系統(tǒng)中AC至少產(chǎn)生了8個(gè)代謝產(chǎn)物（M1～M8）。其中M1～M6為CYP異構(gòu)體參與代謝產(chǎn)生的代謝物，并且O-脫甲基、N-脫乙基、脫氫和加氧反應(yīng)為最主要的CYP代謝途徑。將這些代謝物的結(jié)構(gòu)與AC比較，顯示僅在其側(cè)鏈發(fā)生了變化，表明這些代謝產(chǎn)物可能仍具有藥理活性。構(gòu)效關(guān)系研究顯示，AC的高毒性與以下官能團(tuán)有關(guān)：C8位的乙酰氧基，C13位的羥基，C1、C6、C16、C18位的4個(gè)甲氧基以及C24位的苯氧基酯[8]。代謝物M8為C8位乙酰氧基水解的衍生物，其毒性比AC低得多。代謝物M9、M10和M11也同樣去掉了一些使AC毒性增強(qiáng)的官能團(tuán)，提示經(jīng)微粒體代謝產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能仍具有藥理活性，但毒性會(huì)降低。當(dāng)C8位和C14位上的基團(tuán)發(fā)生水解形成單酯結(jié)構(gòu)后化合物的毒性會(huì)降低，同時(shí)其鎮(zhèn)痛和抗心律不齊的藥理作用會(huì)顯著增強(qiáng)[7]，因此AC經(jīng)C8位水解形成的單酯結(jié)構(gòu)代謝物M8，與AC相比，藥理作用會(huì)增強(qiáng)且毒性會(huì)降低。上述結(jié)果有助于烏頭屬生物堿的中毒和解毒的相關(guān)研究。

此外，AC在體外小鼠和豚鼠肝微粒體中的主要Ⅰ相代謝途徑相同，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，AC在大鼠肝微粒體中產(chǎn)生的主要CYP代謝產(chǎn)物與筆者的研究一致，O-脫甲基、N-脫乙基和脫氫反應(yīng)為最主要的CYP代謝途徑[4]。在人的肝微粒體和尿液中也發(fā)現(xiàn)一致的代謝產(chǎn)物[8]，說(shuō)明由于藥物代謝途徑的不同，產(chǎn)物對(duì)AC藥效或安全性的影響不同而導(dǎo)致的種屬差異的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小。

圖2 質(zhì)譜圖A1.M5的MS圖；A2.M5[M+H]+(m/z 662)的MS2圖；B1.M6的MS圖；B2.M6[M+H]+(m/z 644)的MS2圖；C1.M7的MS圖；C2.M7[M+H]+(m/z 630)的MS2圖；D1.M8的MS圖；D2.M8[M+H]+(m/z 604)的MS2圖Fig 2 Mass chromatogramsA1.MS chromatograms of M5；B1.MS2[M+H]+(m/z 662)of M5；B1.MS chromatograms of M6；B2.MS2[M+H]+(m/z 644)of M6；C1.MS chromatograms of M7；C2.MS2[M+H]+(m/z 630)of M7；D1.MS chromatograms of M8；D2.MS2[M+H]+(m/z 604)of M8

圖3 AC在豚鼠和小鼠肝微粒體中可能的代謝途徑Fig 3 Proposed metabolic pathways of AC in liver microsomes of mice and guinea pig

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