劉 冀 楊發(fā)滿 張培莉 李 蓉 汪元浚 (青海大學(xué)附屬醫(yī)院老年2科，青海 西寧 810001)

本研究對(duì)90例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)患者(漢族、回族、藏族)和90名健康對(duì)照肽?；彼崦搧啺泵?(PADI4)－92、94和104的單核苷酸多態(tài)性(SNP)進(jìn)行分析，以探討其與RA易感性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2010年1月至2011年12月，我院風(fēng)濕科住院及門診RA漢族患者(海拔2 200～2 600 m)30例，玉樹(shù)地區(qū)住院及門診RA藏族(海拔3 800～4 200 m)患者30例，大通塔爾住院及門診RA回族患者(海拔2 700 m)30例，診斷均符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年RA分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，并排除其他自身免疫性疾病;其中男22例，女68例，平均年齡(50±14)歲;健康對(duì)照組90名，分別為各地區(qū)各民族健康體檢者，其中男15名，女75名，平均年齡(49±12)歲。研究對(duì)象均無(wú)血緣關(guān)系，各組年齡及性別等資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 基因組DNA提取 采集受檢者靜脈血5 ml，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA－Na:)抗凝;采用AxyPrep－96全血基因組DNA試劑盒提取白細(xì)胞基因組DNA，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，－80℃保存?zhèn)溆茫珹xyPrep－96全血基因組DNA試劑盒購(gòu)自AXYGEN公司。

1.3 PCR反應(yīng) 在MJ Research PTC－250梯度PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μl加1 μl加樣緩沖液在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。電壓50 V，電泳時(shí)間30～40 min。紫外光下觀察電泳結(jié)果，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。引物序列見(jiàn)表1。以ABI PRISM 3730 DNA測(cè)序儀測(cè)定LDR產(chǎn)物序列長(zhǎng)度后經(jīng)Genemapper分析得出SNP基因型分型結(jié)果。

表1 引物序列

1.4 其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定 抗環(huán)瓜氨酸肽(CCP)抗體采用ELISA法(博爾邁醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司)，紅細(xì)胞沉降率(ESR)采用魏氏法檢測(cè)。

1.5 RA活動(dòng)性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) RA疾病活動(dòng)關(guān)節(jié)評(píng)分28(DAS28)以28個(gè)關(guān)節(jié)計(jì)分DAS28≥5.1為疾病高度活動(dòng);3.2≤DAS28＜5.1為疾病中度活動(dòng);2.6≤DAS28＜3.2為疾病低度活動(dòng);DAS28＜2.6為病情緩解。

1.6 健康評(píng)定問(wèn)卷(HAQ)評(píng)分 采用HAQ問(wèn)卷對(duì)RA患者生存質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分。HAQ殘疾指數(shù)計(jì)算方法:在過(guò)去的1個(gè)月內(nèi)從事以下活動(dòng)的評(píng)價(jià)，①自己穿衣服，包括系鞋帶和紐扣;②上床、下床;③端一滿杯水送到嘴邊;④在室外的平地上行走;⑤自己洗澡，且擦干身體;⑥蹲下，拾起地上的衣服;⑦上、下車。每項(xiàng)得分如下:0=無(wú)困難，1=有些困難，2=很困難，3=不能進(jìn)行。把各項(xiàng)分相加即為總得分。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，用r吻合度檢驗(yàn)分析患者基因型分布是否符合Hardy－Weinberg定律，各基因型及等位基因頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，各基因型與臨床資料相關(guān)性分析采用方差分析、秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Hardy－Weinberg平衡分析 經(jīng)χ2檢驗(yàn)，RA組和健康對(duì)照組 PADI4－94、PADI4－104、PADI4－92 位點(diǎn)實(shí)際基因分布與 Hardy－Weinberg平衡狀態(tài)下的理論分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.760，P=0.184; χ2=1.191，P=0.275; χ2=1.679，P=0.192)，表明均符合該平衡法則，具有群體代表性。

2.2 不同民族RA組與對(duì)照組基因型及其頻率 PADI4－92、PADI4－94及PADI4－104位點(diǎn)存在A和 G、C三種等位基因，A/A、C/C、G/G、A/G，G/C 五種基因型、漢族、回族、藏族 RA 組、健康對(duì)照組 PADI4－94 PADI4－104的A/A、G/G和 A/G基因型頻率，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.105，P=0.949);(χ2=1.105，P=0.949);(χ2=0.657，P=0.720)。(χ2=0.617，P=0.734);(χ2=0.617，P=0.734);(χ2=1.198，P=0.549)。漢族、回族、藏族RA組、健康組PADI4－92的C/C、G/G和G/C基因型頻率組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)(χ2=1.105，P=0.949)(χ2=1.105，P=0.949)(χ2=0.234，P=0.889)。見(jiàn)表 2。

2.3 RA 組 PADI4－94 及 PADI4－104、PADI4－92 各基因型間臨床指標(biāo)的比較 ESR、DAS28評(píng)分、HAQ生活質(zhì)量評(píng)分及抗CCP 抗體在 RA 組 PADI4－94 及 PADI4－104、PADI4－92 各基因型間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 RA組與健康對(duì)照組PADI4-94、PADI4-104、PADI4-92基因型及其頻率〔n(頻率)〕

3 討論

PADI基因是1981年Fujisaki等首先從新生大鼠表皮提取物中分離得到的一種基因。目前，在人體組織中共發(fā)現(xiàn)5種PADI酶(即 PADll，2、3、4、6)，其中，PADI4 與 RA 關(guān)系最為密切。人類PADI4基因定位于染色體1p36上的NT.034367.1區(qū)域。PADI是一種翻譯后修飾酶，可以催化抗原蛋白多肽進(jìn)行瓜氨酸化反應(yīng)，并在鈣離子存在的情況下把精氨酸殘基轉(zhuǎn)化成瓜氨酸殘基，形成瓜氨酸肽，打破機(jī)體的免疫耐受而誘發(fā)RA的發(fā)生。由于瓜氨酸肽的形成有賴于PADI的存在。因此，PADI基因是RA發(fā)病的重要因素。研究證實(shí)，PADI4在人細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和基因轉(zhuǎn)錄等〔1〕。在整個(gè)PADI4基因上，從5′非翻譯區(qū)的啟動(dòng)子序列到3′非翻譯區(qū)，目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè) SNP位點(diǎn)，PADI4－89(外顯子2，163G→A)、PADI4－90(外顯子 2，245G→C)、PADI4_92(外顯子3，335G→C)、PADI4－104(外顯子 4，349T→C)以及內(nèi)含子區(qū)域PADI4_94(內(nèi)含子3，28017T→C)的SNPs是研究的熱點(diǎn)。X射線分析表明這些氨基酸置換發(fā)生在肽鏈N端，遠(yuǎn)離蛋白活性部位，并不會(huì)直接影響PADI4的催化功能，也不影響二聚體的連接，目前尚不清楚這些突變是否影響到酶與核受體或靶蛋白的相互作用〔2〕。故深入探討PADI4與RA易感性有助于進(jìn)一步闡明RA的病理及發(fā)病機(jī)制。

RA是一種具有遺傳傾向的多基因疾病，在遺傳因素中，人類白細(xì)胞抗原(HLA)所起的作用也只有30% ～50%，其余50%－70%的HLA影響RA易感性的基因分布至今未明。Suzuki等〔3〕采用SNP方法對(duì)日本人進(jìn)行病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)，PADI4基因與RA的易感性相關(guān)。該研究通過(guò)分析PADI4基因中的17 個(gè) SNPs，發(fā)現(xiàn)其中的 8 個(gè) SNPs(PADI4－92、PADI4－94、PADI4－104、PADI4－95、PADI4－97、adi4_99、PADI4－100、PADI4－101) 與RA有很強(qiáng)的相關(guān)性。其中PADI4－94與RA的聯(lián)系尤為顯著。日本、韓國(guó)研究也證實(shí)了RA與PADI4的相關(guān)性。Plenge等〔4〕在北美和瑞典人群中對(duì)RA關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)PADI4－94是RA的易感基因，可見(jiàn)PADI4是RA易感基因。本研究結(jié)果顯示 PADI4－94 及 PADI4－104、PADI4－92 基因多態(tài)性與 RA 易感性無(wú)關(guān)，與我國(guó)史恒星等〔5〕及西班牙 Martinez等〔6〕研究結(jié)果一致。此外，在錢龍等〔7〕研究證實(shí)，PADI4－92基因多態(tài)性與RA無(wú)明顯相關(guān)性也與本研究結(jié)果符合。隨后，Barton等〔8〕利用連鎖與關(guān)聯(lián)的基本策略分析方法對(duì)英國(guó)人群中PADI4基因進(jìn)行分析，PADI4基因的SNPs或單體型均與RA發(fā)病無(wú)關(guān)。同時(shí)，在對(duì)德國(guó)人和西班牙人的研究中也發(fā)現(xiàn)PADI4基因多態(tài)性與RA無(wú)相關(guān)性。PADI4與RA的關(guān)聯(lián)性可能取決于種群之間的遺傳異質(zhì)性。

Vossenaar等〔9〕報(bào)道了蛋白質(zhì)瓜氨酸化是在PAD酶的作用下精氨酸殘基發(fā)生翻譯后修飾形成瓜氨酸殘基的過(guò)程。通常情況下，PAD酶以非活性形式存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞死亡后，胞膜的完整性缺失，胞內(nèi)PAD酶外流，在細(xì)胞外足夠高的Ca2+濃度的環(huán)境下，PAD酶被激活并導(dǎo)致細(xì)胞外蛋白質(zhì)的瓜氨酸化。患者的炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中出現(xiàn)瓜氨酸化蛋白并非RA所特有，瓜氨酸化蛋白也可以在如骨關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎等其他患者的炎癥關(guān)節(jié)滑膜組織中檢出，蛋白質(zhì)瓜氨酸化是與關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)的標(biāo)志而非RA特異性標(biāo)志，而瓜氨酸化蛋白驅(qū)動(dòng)的瓜氨酸化蛋白特異性B細(xì)胞的成熟以及由此產(chǎn)生的抗CCP抗體才是RA所特有的，抗CCP抗體促使關(guān)節(jié)炎癥持續(xù)存在并轉(zhuǎn)化為慢性RA或重癥RA。Cha等〔10〕報(bào)道，PADI4可能在RA早期(≤34個(gè)月)發(fā)揮作用，并影響抗CCP抗體的產(chǎn)生。但大多歐美國(guó)家研究均表明，PADI4各基因型與抗CCP抗體無(wú)相關(guān)性，可見(jiàn)PADI4參與了蛋白質(zhì)的瓜氨酸化，參與了RA發(fā)病，但在不同種族中可能作用不同。本研究顯示，RA患者血清中PADI4水平與抗CCP抗體無(wú)相關(guān)性，與大多數(shù)歐美國(guó)家PADI4基因?qū)用娴难芯拷Y(jié)果一致。

可見(jiàn)，PADI4可能參與了RA發(fā)病，間接參與RA抗體的形成及關(guān)節(jié)破壞進(jìn)展。本研究中PADI4基因與抗CCP抗體形成無(wú)相關(guān)性，可能與樣本量小及病例選擇偏倚有關(guān)。除PADI4－94和 PADI4－104、PADI4－92 三型，抗 CCP 抗體形成可能與 PADI4基因其他亞型相關(guān)，這有待于大樣本多亞型研究。

1 Arita K，Shimizu T，Hashimoto H，et al.Structural basis for histone N－terminal recognition by human peptidylarginine deiminase 4〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2006;103(14):5291－6.

2 Arita K，Hashimoto H，Shimizu T，et al.Structural basis for Ca(2+)induced activation of human PAD 4〔J〕.Nat Struct Mol Biol，2004;11(8):777－83.

3 Suzuki M，Miyagi J，Kuribayashi M，et al.Evaluation of allele frequencies in the PADI4 gene and anti－cyclic eitrullinated peptide antibodies of patients with rheumatoid arthritis in a Japanese population〔J〕.Ann Rheum Dis，2006;65(10):1399－400.

4 Plenge RM，Padyukov L，Remmers EF，et al.Replication of putative candidate－gene association with rheumatoid arthritis in ＞ 4000 samples from North America and Sweden:association of susceptibility with PTPN22，CTLA4，and PADI4〔J〕.Am J Hum Genct，2005;77(6):1044－60.

5 史恒星，錢 龍，李向培，等.肽?；彼崦搧啺泵福?基因多態(tài)性與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性〔J〕.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010;14(5):336－9.

6 Martinez A，Valdivia A，Pascual－Salcedo D，et al.PADI4 polymorphisms are not associated with rheumatoid arthritis in the Spanish population〔J〕.Rheumatology(Oxford)，2005;44(10):1263－6.

7 錢 龍，史恒星，李向培，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清肽?；彼崦搧啺泵?水平及其意義〔J〕.中華內(nèi)科雜志，2011;50(2):107－10.

8 Barton A，Bowes J，Eyre S，et al.A functional haplotype of the PADI4 gene associated with rheumatoid arthritisin a Japanese population is not associated in Aunited Kingdom population〔J〕.Arthritis Rheum，2004;50(4):1117－21.

9 Vossenaar ER，van Venrooij WJ.Citrullinated proteins:sparks that may ignite the fire in rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Res Ther，2004;6(3):107－11.

10 Cha S，Choi CB，Han TU，et al.Association of anti－cyclic citrullinated peptide antibody levels with PADI4 haplotypes in early rheumatoid arthritis and with shared epitope alleles in very late rheumatoid arthritis〔J〕.Arthritis Rheum，2007;56(5):1454－63.