張俊芳，張忠敏，趙 鑫，劉愛(ài)明，郭潔潔，沈璐艷，王欽文，王 闖△

(1寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波 315211;2牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

抑郁癥與焦慮癥作為神經(jīng)精神領(lǐng)域兩大心境障礙性疾病，嚴(yán)重威脅著患者的生活及工作。抑郁癥以持續(xù)性心境障礙及興趣降低為主，并伴隨其它心理及軀體癥狀，以其高患病率、復(fù)發(fā)率及自殺率成為神經(jīng)精神科學(xué)界研究的重點(diǎn)。焦慮癥又稱焦慮性神經(jīng)癥，是一種以焦慮情緒為主的神經(jīng)癥，主要表現(xiàn)為發(fā)作性或持續(xù)性的焦慮、緊張、驚恐不安等焦慮情緒，并伴有自主神經(jīng)紊亂、肌肉緊張與運(yùn)動(dòng)不安等癥狀。大量研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥與焦慮癥具有較高的共患率，彼此“如影隨形”。據(jù)WHO和美國(guó)Michigan大學(xué)流行病學(xué)調(diào)查顯示，兩者共患率達(dá) 50%［1］，并且85%的抑郁癥患者伴有焦慮癥狀［2］。因此，尋找兩種疾病的共同藥物作用靶標(biāo)具有重要的研究意義。單胺神經(jīng)系統(tǒng)在人和動(dòng)物的抑郁癥及焦慮癥發(fā)病中起著重要作用?，F(xiàn)存的抗抑郁及抗焦慮藥物能夠迅速改善腦內(nèi)單胺類遞質(zhì)的改變，但是其藥效的發(fā)揮卻延遲到持續(xù)給藥3～8周后。這表明單胺能神經(jīng)系統(tǒng)作為抗抑郁及抗焦慮藥物作用靶標(biāo)有待證實(shí)［3］。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3，GSK3)與精神疾病具有較強(qiáng)的相關(guān)性。其作為高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶在中樞神經(jīng)系統(tǒng)大量表達(dá)且具有重要調(diào)控作用。GSK3有2種高度同源(84%序列同源)的亞型:GSK3α和GSK3β。情感穩(wěn)定劑鋰鹽對(duì)GSK3抑制作用的發(fā)現(xiàn)［4］，使其在情感障礙病理生理機(jī)制中的作用受到重視，其中GSK3β的研究較為深入，本文將對(duì)GSK3α和GSK3β在抑郁和焦慮樣行為中的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制進(jìn)行深入研究。大量研究發(fā)現(xiàn)GSK3α和GSK3β的活性可受磷酸化調(diào)節(jié):絲氨酸殘基Ser21-GSK3α和Ser9-GSK3β被磷酸化后分別介導(dǎo)GSK3α和GSK3β的活性抑制;酪氨酸殘基Tyr279-GSK3α和Tyr216-GSK3β被磷酸化后分別介導(dǎo)GSK3α和GSK3β的活性增強(qiáng)。GSK3在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要介導(dǎo)胰島素樣受體、生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response elementbinding protein，CREB)等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)干擾信號(hào)分子的表達(dá)及下游基因表達(dá)、神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)、炎癥及凋亡過(guò)程等，最終誘導(dǎo)多種神經(jīng)精神癥狀［5-6］。因此，GSK3有望成為調(diào)控抑郁樣及焦慮樣行為癥狀的有效藥物作用靶標(biāo)。事實(shí)上，選擇GSK3作為情緒障礙(mood disorders)治療的藥物作用靶標(biāo)起源于1996年報(bào)道發(fā)現(xiàn)鋰可以作為GSK3的抑制劑，通過(guò)增強(qiáng)GSK3的抑制性絲氨酸殘基磷酸化直接抑制GSK3和介導(dǎo)蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB)信號(hào)通路間接抑制GSK3的活性而發(fā)揮作用［7-8］。然而 GSK3 尤其是 Ser21-GSK3α、Ser9-GSK3β、Tyr279-GSK3α 和 Tyr216-GSK3β 在慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，cAMP和cGMP作為第二信使參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑郁癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)是催化 cAMP和cGMP水解酶超級(jí)家族。PDE目前有11個(gè)家族成員(PDE1～11)。其中，PDE4、PDE7和 PDE8為 cAMP特異性的水解酶，PDE5、PDE6和PDE9為cGMP特異性的水解酶，其它PDE則以這2種第二信使為底物，對(duì)cAMP和cGMP均可水解［9］。cAMP作為體內(nèi)重要的第二信使，對(duì)眾多的細(xì)胞功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多巴胺、去甲腎上腺素、5-羥色胺以及谷氨酸的突觸傳遞。因此，通過(guò)有效調(diào)節(jié)PDE4水平，從而上調(diào)cAMP，有望在抑郁癥及焦慮癥治療中發(fā)揮重要作用。但是，PDE4具有A、B、C及D四種亞型，且研究發(fā)現(xiàn)PDE4 A、B及D亞型在中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有較高表達(dá)，PDE4 C亞型僅在外周系統(tǒng)表達(dá)。因此，闡明何種亞型在情緒障礙中的調(diào)節(jié)作用將為發(fā)現(xiàn)新型抗抑郁及抗焦慮藥物新靶標(biāo)提供希望。目前最新研究表明，PDE4D在海馬內(nèi)高度分布且作為cAMP的主要水解亞型有望成為新型抗抑郁及抗焦慮藥物新靶標(biāo)。因此，探討慢性應(yīng)激動(dòng)物模型腦內(nèi)PDE4的表達(dá)，尤其在水解cAMP及抑郁癥、焦慮癥的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用的PDE4D的表達(dá)，值得進(jìn)一步關(guān)注。

咯利普蘭(rolipram)是一種高效的PDE4特異性抑制劑，一直以來(lái)作為抑郁癥研究領(lǐng)域的一個(gè)重要工具藥被大量研究。盡管rolipram由于致嘔吐等不良反應(yīng)在進(jìn)入臨床試驗(yàn)后很快退市，但是臨床前研究顯示rolipram等PDE4抑制劑可能是通過(guò)cAMP/蛋白激酶(protein pinase A，PKA)/CREB/BDNF信號(hào)通路在抗抑郁癥中發(fā)揮了重要調(diào)節(jié)作用［10］，并且也顯示出良好的抗焦慮樣作用。還有研究顯示BDNF可能通過(guò)介導(dǎo)PKB等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)GSK3的磷酸化過(guò)程發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。因此，有理由相信rolipram可能會(huì)通過(guò)BDNF進(jìn)一步介導(dǎo)GSK3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。但是，rolipram的抗抑郁及抗焦慮作用是否單純通過(guò)CREB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用?rolipram能否介導(dǎo)GSK3這個(gè)在情緒調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)因子?CREB介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否對(duì)GSK3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用?這一系列問(wèn)題本研究將予以重點(diǎn)闡明。

材料和方法

1 動(dòng)物

成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重(150～180)g(寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度維持在(23±2)℃，濕度保持在(55±15)%，光/暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間6:00～18:00)。自由飲食，飼養(yǎng)1周以適應(yīng)環(huán)境后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)流程。每天給藥前記錄動(dòng)物體重，分析實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)動(dòng)物體重變化情況。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)寧波大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，遵照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)程(NIH Publications No.80～23)進(jìn)行。

2 主要試劑

氯化鋰(LiCl;Sigma-Aldrich)及rolipram(Sigma-Aldrich)分別溶于含有1%DMSO(Sigma-Aldrich)的生理鹽水，置于4℃冰箱中備用。LiCl(100 mg/kg)及 rolipram(1 mg/kg)按照 10 mL·kg-1·d-1每日固定時(shí)間腹腔注射給藥，空白對(duì)照組與模型組給予等量的空白溶劑。H89(PKA拮抗劑;Sigma-Aldrich)由人工腦脊液配制溶解(6×106μg/L)，每次使用前現(xiàn)配現(xiàn)用。

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 (1)40只SD大鼠(150～180 g)隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥LiCl組及rolipram組。所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后在不給予任何處理因素前提下第0 d進(jìn)行1次曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，第1 d開(kāi)始模型組、LiCl組及rolipram組每日固定時(shí)間分別腹腔注射空白溶劑、LiCl(100 mg/kg)及rolipram(1 mg/kg)，1 h后進(jìn)行慢性束縛應(yīng)激，每天束縛6 h?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行束縛應(yīng)激，但每天固定時(shí)間在同一實(shí)驗(yàn)環(huán)境飼養(yǎng)，并腹腔注射等量空白溶劑。第22 d，4組動(dòng)物給藥后1 h，進(jìn)行強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的適應(yīng)訓(xùn)練，每只動(dòng)物自由游泳15 min。24 h后，即第23 d進(jìn)行檢測(cè)，每只動(dòng)物游泳5 min，并記錄分析每只動(dòng)物的逃避行為(攀爬、游泳)及不動(dòng)時(shí)間。第24 d進(jìn)行高架十字迷宮測(cè)試，以檢測(cè)動(dòng)物的焦慮樣行為。第25 d再次進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，以分析應(yīng)激及藥物對(duì)動(dòng)物的影響。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死動(dòng)物并取雙側(cè)海馬組織，免疫印跡法檢測(cè)海馬內(nèi)分子指標(biāo)的變化，流程見(jiàn)圖1A。(2)30只SD大鼠(180～200 g)平均分為6組，雙側(cè)海馬CA1區(qū)手術(shù)埋管并恢復(fù)7 d后進(jìn)行慢性應(yīng)激處理21 d，并在應(yīng)激前微量注射H89，腹腔注射LiCl和rolipram。每次實(shí)驗(yàn)前將H89(6×106μg/L)生理鹽水以1 μL/min的速度緩慢注射至CA1區(qū)，每側(cè)分別注射1 μL，注射完畢后留針5 min以防液體返流。雙側(cè)海馬用于檢測(cè)PDE4D、PKA、p-CREB及磷酸化絲氨酸殘基9糖原合成酶激酶3β(p-Ser9-GSK3β)的表達(dá)，流程見(jiàn)圖1B。

Figure 1.Schedules of drug treatments and behavioral tests.A:the first open field test(OFT)was conducted on day 0 before drug treatments and stress.Behavioral tests was carried out on days 22～25(1 h after the injection of drugs or vehicle).B:seven days after the surgery，chronic restraint stress was conducted for 21 d after microinjection of PKA antagonist(H89)and intraperitoneal(ip)injection of lithium chloride(LiCl)and rolipram everyday.FST:forced swimming test;EPM:elevated plus-maze圖1 實(shí)驗(yàn)給藥及行為學(xué)流程

3.2 大鼠海馬CA1區(qū)手術(shù)埋管 將大鼠用水合氯醛10 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于立體定位儀。消毒、切開(kāi)頭部皮膚(以兩眼連線的中點(diǎn)為起點(diǎn)，兩耳后緣連線的中點(diǎn)為終點(diǎn))，暴露手術(shù)視野，用棉簽蘸少許50%H2O2涂于顱骨表面使前囟清晰暴露，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，后退3.5 mm，旁開(kāi)2.5 mm處鉆孔，為左右兩側(cè)海馬的進(jìn)入點(diǎn)。以軟腦膜為起始點(diǎn)將定做好的定位管進(jìn)針3.0 mm，進(jìn)入海馬CA1區(qū)，用牙科牙托粉固定，并使動(dòng)物術(shù)后恢復(fù)1周時(shí)間。

3.3 慢性束縛應(yīng)激(chronic restrain stress) 由透明鋼化玻璃統(tǒng)一制作的長(zhǎng)度22 cm、直徑8 cm的束縛器，前端有通氣孔用于動(dòng)物呼吸外界空氣，尾端為設(shè)計(jì)一可關(guān)閉的圓形門。動(dòng)物面朝頂端被輕柔放置入束縛器后迅速關(guān)閉尾端的門，并開(kāi)始計(jì)時(shí)。每天同一時(shí)間進(jìn)行束縛應(yīng)激，每次每只動(dòng)物進(jìn)行6 h。

3.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(open field test) 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間等，評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在陌生環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法。實(shí)驗(yàn)裝置由曠場(chǎng)反應(yīng)箱和數(shù)據(jù)自動(dòng)采集和處理系統(tǒng)兩部分組成。大鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱高30～40 cm，底邊長(zhǎng)100 cm，內(nèi)壁涂黑，底面平均分為25個(gè)4 cm×4 cm小方格，正上方2 m處架一數(shù)碼攝像頭，其視野可覆蓋整個(gè)曠場(chǎng)內(nèi)部。曠場(chǎng)光照為全人工照明，可人為設(shè)定“白天”和“黑夜”，白天由兩側(cè)墻壁的4只節(jié)能燈發(fā)出約200 Lux照度來(lái)模擬，夜晚由一側(cè)墻壁的紅外光源提供照明。實(shí)驗(yàn)人員和計(jì)算機(jī)等設(shè)備位于另一房間以減小對(duì)動(dòng)物的干擾，實(shí)驗(yàn)室背景噪音控制在65 dB以下。將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)，觀察時(shí)間設(shè)定為5 min。每只動(dòng)物檢測(cè)后清洗方箱內(nèi)壁及底面，以免上次動(dòng)物余留的信息(如動(dòng)物的大/小便、氣味)影響下次測(cè)試結(jié)果。根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件記錄并分析動(dòng)物肢體越過(guò)的格子數(shù)即水平得分(crossing)、后肢站立次數(shù)即垂直得分(rearing)和修飾次數(shù)(grooming)。

3.5 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)(forced swimming test) 該實(shí)驗(yàn)方法是一種行為絕望實(shí)驗(yàn)法，其基本原理是將大鼠放進(jìn)一個(gè)有限的空間(直徑20 cm，水面高度30 cm，高度50 cm的圓筒狀塑膠玻璃器皿內(nèi))使之游泳，開(kāi)始時(shí)拼命游泳力圖逃脫，很快就變成漂浮不動(dòng)狀態(tài)，僅露出鼻孔保持呼吸，四肢偶爾劃動(dòng)以保持身體不至于沉下去，實(shí)際是動(dòng)物放棄逃脫的希望，屬于行為絕望，反映了動(dòng)物的抑郁樣行為。實(shí)驗(yàn)包括訓(xùn)練階段及測(cè)試階段:第22 d各組動(dòng)物依次游泳15 min，以適用環(huán)境;第23 d進(jìn)行測(cè)試，每只動(dòng)物游泳5 min，并記錄動(dòng)物在5 min內(nèi)的攀爬時(shí)間(climbing)、游泳時(shí)間(swimming time)及不動(dòng)時(shí)間(immobility)。攀爬行為定義為:動(dòng)物在游泳過(guò)程中前肢順著器皿方向主動(dòng)向上運(yùn)動(dòng);游泳時(shí)間定義為:動(dòng)物在器皿內(nèi)主動(dòng)地游泳運(yùn)動(dòng)的時(shí)間;不動(dòng)時(shí)間定義為:動(dòng)物在器皿內(nèi)不表現(xiàn)任何逃避行為的時(shí)間。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，水溫保持在(23±2)℃。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后更換器皿內(nèi)的水以保持水的清潔，消除動(dòng)物糞便及氣味的干擾。

3.6 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)(elevated plus-maze) 高架十字迷宮是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和對(duì)高懸敞開(kāi)臂的恐懼形成矛盾沖突行為來(lái)考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)儀器由黑色塑膠玻璃做成，包括開(kāi)臂區(qū)(長(zhǎng)50 cm，寬10 cm)，閉臂(長(zhǎng)50 cm，寬10 cm，高20 cm)及中央?yún)^(qū)(10 cm×10 cm)，相同類型的臂通過(guò)中央?yún)^(qū)相對(duì)連接。整個(gè)儀器置于距離地面50 cm的位置。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)面對(duì)閉臂置于中央?yún)^(qū)位置，并使動(dòng)物自由探索5 min，記錄:(1)進(jìn)入開(kāi)臂及閉臂的次數(shù);(2)在開(kāi)臂及閉臂內(nèi)的停留時(shí)間(動(dòng)物的四肢全部進(jìn)入一個(gè)臂內(nèi)方可認(rèn)為有效)。每只動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用10%乙醇進(jìn)行清洗實(shí)驗(yàn)儀器以消除動(dòng)物氣味的干擾。

（1）土地及植被破壞面積估計(jì)。工程建設(shè)過(guò)程中，地面設(shè)施的興建、開(kāi)挖、填筑等都不同程度、不同形式地?cái)_動(dòng)了原地貌形態(tài)，損壞了地表土體結(jié)構(gòu)和地面林草植被。根據(jù)對(duì)主體工程報(bào)告的分析及現(xiàn)場(chǎng)勘察，工程建設(shè)占?jí)和恋?、擾動(dòng)原地表面積共37.06hm2。

3.7 免疫印跡實(shí)驗(yàn) 100 mg腦組織加入含有蛋白酶抑制劑的1 mL裂解液中，盡量保持低溫并快速勻漿(13000 r/min，4℃)，離心30 min，取少量上清進(jìn)行蛋白濃度定量;將所有組織蛋白濃度定量至4×106μg/L，并與2倍的上樣緩沖液1∶1混合后100℃沸水浴5 min，將所有樣本冷卻后保存至-20℃冰箱中備用。每組上樣50 μg，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，60 V穩(wěn)定電壓轉(zhuǎn)膜3 h至PVDF膜，并用封閉液封閉2 h，TBST清洗5 min后分別加入Ⅰ抗［家兔來(lái)源抗 PDE4D(1∶800)、PKA(1∶1000)、p-CREB(1∶1500)、BDNF(1 ∶500)、p-Ser21-GSK3α(1∶1000)、p-Ser9-GSK3β(1∶1000)、p-Tyr279-GSK3α(1∶1000)、p-Tyr216-GSK3β(1∶1000)、total GSK3α(1∶2000)、total GSK3β (1∶2000)和小鼠來(lái)源抗GAPDH(1∶5000);Millopore］后置于4℃冷庫(kù)振蕩過(guò)夜。TBST清洗I抗后常溫孵育II抗［山羊抗兔IgG(1∶10000)及山羊抗小鼠 IgG(1∶10000);Cell Signal］1 h，TBST清洗后曝光照相。并采用軟件BandScan分析結(jié)果，以GAPDH為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Rolipram對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的體重丟失的影響

各組動(dòng)物在第0 d體重(即初始體重)無(wú)顯著差異。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析顯示時(shí)間效應(yīng)(day)［F(3，108)=900.500，P ＜0.01］，處理效應(yīng)(treatment)［F(3，108)=6.685，P ＜0.01］以及時(shí)間效應(yīng)與處理效應(yīng)的交互作用(day×treatment)［F(9，108)=10.750，P＜0.01］均有顯著差異。隨著慢性應(yīng)激的持續(xù)進(jìn)行，應(yīng)激組動(dòng)物與空白對(duì)照組相比體重逐漸丟失，比較顯示第14 d(P＜0.01)及21 d(P＜0.01)體重下降顯著，而LiCl及rolipram與應(yīng)激組相比在第14 h(LiCl，P＜0.05;rolipram，P＜0.01)及21 h(LiCl，P＜0.01;rolipram，P＜0.01)均顯示出明顯逆轉(zhuǎn)了體重下降效應(yīng)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Effects of chronic restraint stress and rolipram administration on body weight in 21 days.Data were analyzed using repeated measures ANOVA followed by Bonferroni post test.E.n=10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖2 慢性束縛應(yīng)激及rolipram對(duì)21 d內(nèi)動(dòng)物體重的影響

2 Rolipram對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的影響

接受23 d慢性束縛應(yīng)激的應(yīng)激組大鼠與空白對(duì)照組相比，在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)，表現(xiàn)出抑郁樣行為特征。各組不動(dòng)時(shí)間的總體比較差異顯著［F(3，36)=18.100，P ＜0.01］，兩兩比較顯示應(yīng)激組動(dòng)物與空白對(duì)照組相比不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.01)，而LiCl(P＜0.01)與rolipram(P＜0.01)均顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)，見(jiàn)圖3A。進(jìn)一步分析動(dòng)物的攀爬次數(shù)表明，應(yīng)激組與空白對(duì)照組相比顯著降低了動(dòng)物的攀爬次數(shù)(P＜0.01)，而LiCl(P＜0.05)與rolipram(P＜0.01)均顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)，表明rolipram顯著逆轉(zhuǎn)了抑郁樣行為效應(yīng)，見(jiàn)圖3B。然而，各組動(dòng)物游泳時(shí)間的比較均未見(jiàn)顯著差異［F(3，36)=0.447，P ＞ 0.05］，表明各組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)行為能力無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖3C。

Figure 3.Effect of rolipram on depression-like behavior induced by chronic restraint stress，including immobility time(A)，climbing behavior(B)，and swimming behavior(C)in forced swimming test.Data were analyzed using one-way ANOVA followed by Bonferroni post test.E.n=10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖3 Rolipram對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁樣行為的影響

3 Rolipram對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮樣行為的影響

高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)顯示，各組動(dòng)物在開(kāi)臂內(nèi)時(shí)間比［F(3，36)=11.450，P ＜0.01］(圖4A)及穿越開(kāi)臂次數(shù)［F(3，36)=5.101，P ＜0.01］(圖4B)的總體比較差異顯著，兩兩比較顯示應(yīng)激組動(dòng)物與空白對(duì)照組相比在開(kāi)臂內(nèi)時(shí)間比(P＜0.01)及穿越開(kāi)臂次數(shù)均顯著降低(P＜0.01)，而LiCl(P＜0.01;P＜0.01)與rolipram(P＜0.01;P＜0.01)組均顯著逆轉(zhuǎn)了這兩項(xiàng)指標(biāo)，表現(xiàn)出顯著抗焦慮作用。然而，各組穿越閉臂次數(shù)未見(jiàn)顯著差異［F(3，36)=0.317，P＞0.05］，表明各組動(dòng)物的自主活動(dòng)能力無(wú)顯著差異，見(jiàn)圖4B。在高架十字迷宮中慢性束縛應(yīng)激在誘導(dǎo)動(dòng)物焦慮樣行為的同時(shí)，未見(jiàn)其對(duì)動(dòng)物自主行為能力產(chǎn)生顯著影響，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Effect of rolipram on anxiety-like behavior induced by chronic restraint stress，including percentage of time spent in openarm exploration(A)and the numbers of entries into open or closed arm(B)in elevated plus-maze.Data were analyzed using one-way ANOVA followed by Bonferroni post test.E.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖4 Rolipram對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮樣行為的影響

4 應(yīng)激前及應(yīng)激25 d后各組動(dòng)物在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)比較

應(yīng)激前(即第0 d)進(jìn)行的曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明，各組動(dòng)物水平穿格次數(shù)(P＞0.05)、直立次數(shù)(P＞0.05)及修飾次數(shù)(P＞0.05)均未見(jiàn)顯著差異，見(jiàn)圖5A;經(jīng)過(guò)25 d的慢性束縛應(yīng)激后再次進(jìn)行曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)表明，慢性應(yīng)激組動(dòng)物與空白對(duì)照組相比水平穿格次數(shù)(P＜0.01)、直立次數(shù)(P＜0.05)及修飾次數(shù)(P＜0.01)均顯著降低，而 LiCl(P＜0.01;P＜0.05;P＜0.01)與rolipram(P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01)均顯著逆轉(zhuǎn)了這些效應(yīng)，提示rolipram具有逆轉(zhuǎn)抑郁樣行為效應(yīng)，見(jiàn)圖5B。另外，這一實(shí)驗(yàn)也表明慢性束縛應(yīng)激建立的大鼠抑郁模型是可靠的。

Figure 5.The open field locomotor activities before(A)or after(B)chronic restraint stress，including crossing，rearing and grooming.Data were analyzed using oneway ANOVA following by Bonferroni post test.E.n=10.*P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group.圖5 應(yīng)激前及應(yīng)激25 d后各組動(dòng)物在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中行為學(xué)比較

5 Rolipram對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的p－CREB、BDNF和PKA表達(dá)下調(diào)的影響及PKA抑制劑H89的阻斷作用

大量研究表明cAMP-CREB-BDNF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗抑郁及抗焦慮中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激25 d后應(yīng)激組與空白組相比，海馬內(nèi)p-CREB(圖6B)及BDNF(圖6C)表達(dá)顯著下調(diào)［p-CREB，F(xiàn)(3，12)=8.471，P ＜0.01;BDNF，F(xiàn)(3，12)=4.439，P ＜0.05］，rolipram顯著逆轉(zhuǎn)了p-CREB及BDNF表達(dá)的下調(diào)(p-CREB，P＜0.01;BDNF，P ＜0.05)，而LiCl未見(jiàn)對(duì)p-CREB及BDNF表達(dá)的顯著增高，僅僅表現(xiàn)出輕微上調(diào)作用。進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，慢性束縛應(yīng)激21 d后應(yīng)激組與空白組相比，海馬內(nèi)p-CREB表達(dá)顯著下調(diào)［F(5，24)=43.260，P ＜ 0.01］，見(jiàn)圖 6F，海馬內(nèi)PKA的表達(dá)也顯著下調(diào)［F(5，24)=51.090，P＜0.01］，見(jiàn)圖6E，并且PKA抑制劑H89顯著阻斷了rolipram對(duì)p-CREB(P＜0.01)及PKA(P＜0.01)的上調(diào)作用，見(jiàn)圖6E-F。

6 Rolipram對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下GSK3及其不同磷酸化狀態(tài)表達(dá)的影響和PKA抑制劑H89的阻斷作用

Figure 6.Effects of rolipram and H89 on down-regulation of p-CREB(B and F)，BDNF(C)and PKA(E)expression induced by chronic restraint stress in the hippocampus of rats.Data were analyzed using one-way ANOVA following by Bonferroni post test.E.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs vehicle group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group;▲▲P＜0.01 vs LiCl+stress group;△△P＜0.01 vs rolipram+stress group.圖6 Rolipram及PKA抑制劑H89對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)的p－CREB、BDNF和PKA表達(dá)下調(diào)的影響

7 Rolipram對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下PDE4D表達(dá)的影響

慢性束縛應(yīng)激21 d，動(dòng)物海馬內(nèi)PDE4D的表達(dá)顯著提高［F(5，24)=13.840，P ＜0.01］，rolipram 顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)(P＜0.01)，提示rolipram可能主要通過(guò)抑制PDE4D的活性發(fā)揮上調(diào)PKA/CREB信號(hào)通路;而LiCl并未能顯著下調(diào)PDE4D的表達(dá)［F(5，24)=13.840，P ＞ 0.05］，提示 LiCl對(duì) GSK3 介導(dǎo)的信號(hào)通路的影響可能并不通過(guò)PKA/CREB信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，見(jiàn)圖8。

討 論

為了研究藥物對(duì)動(dòng)物抑郁和焦慮樣行為的影響，我們選擇了大鼠慢性束縛應(yīng)激模型，這是基于大量研究表明慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)了哺乳動(dòng)物的抑郁和焦慮樣行為［11-12］。我們將大鼠慢性束縛應(yīng)激時(shí)間每日由4 h增加到6 h，持續(xù)進(jìn)行3周以上，發(fā)現(xiàn)慢性束縛應(yīng)激顯著增強(qiáng)了動(dòng)物在強(qiáng)迫游泳中的不動(dòng)時(shí)間并顯著降低了高架十字迷宮中動(dòng)物的開(kāi)臂探索行為，表現(xiàn)出穩(wěn)定的抑郁和焦慮樣行為。故本實(shí)驗(yàn)證明慢性束縛應(yīng)激與慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激相比雖然應(yīng)激方式單調(diào)，但應(yīng)激時(shí)間較久、刺激性較強(qiáng)，可以成為一種較好的獲得抑郁癥及焦慮癥動(dòng)物模型的方法。因此，本實(shí)驗(yàn)在眾多誘導(dǎo)手段中［13］選擇此方法作為誘導(dǎo)模型，具有穩(wěn)定、易操作、干擾因素少等特點(diǎn)，為研究抑郁與焦慮共患病提供了良好的動(dòng)物模型。

Figure 7.Effects of rolipram and H89 on expression of total GSK3α (F)，total GSK3β (G)，p-Ser21-GSK3α (B)，p-Ser9-GSK3β(C and I)，p-Tyr279-GSK3α(D)，p-Tyr216-GSK3β(E).E.n=4～5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs vehicle trol group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs vehicle+stress group;△△P＜0.01 vs rolipram+stress group.圖7 Rolipram及H89對(duì)慢性應(yīng)激誘導(dǎo)下total GSK3α、total GSK3β及其不同磷酸化狀態(tài)(p－Ser21－GSK3α、p－Ser9－GSK3β、p－Tyr279－GSK3α和 p－Tyr216－GSK3β)表達(dá)的影響

Figure 8.Effects of rolipram and H89 on down-regulation of PDE4D induced by chronic restraint stress.E.n=5.＊＊P ＜0.01 vs vehicle group;##P ＜0.01 vs vehicle+stress group.圖8 Rolipram及H89對(duì)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的PDE4D上調(diào)作用的影響

慢性束縛應(yīng)激模型穩(wěn)定地誘導(dǎo)出抑郁和焦慮樣行為，再次證明了:(1)抑郁癥與焦慮癥共患率高的特點(diǎn);(2)慢性應(yīng)激因素是抑郁癥與焦慮癥患病的共同發(fā)病因素;(3)該動(dòng)物模型腦內(nèi)信號(hào)變化為尋求抗抑郁及抗焦慮藥物新靶標(biāo)提供了研究思路。大量研究已表明，cAMP/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅在認(rèn)知功能、而且在抗抑郁及抗焦慮中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［14-15］。cAMP特異性水解酶抑制劑——rolipram 因具有顯著的致嘔吐作用而未能進(jìn)入臨床，但其作為PDE4抑制劑工具藥通過(guò)上調(diào)cAMP/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善認(rèn)知功能［16］、抗抑郁［17］及抗焦慮［15］的作用已被廣泛研究。然而也有研究發(fā)現(xiàn)rolipram不僅無(wú)抗焦慮作用，反而可以誘導(dǎo)焦慮樣行為［18］，這提示rolipram對(duì)情緒穩(wěn)定的作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)學(xué)說(shuō)研究表明BDNF作為一個(gè)重要的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在cAMP/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能執(zhí)行(認(rèn)知增強(qiáng)、抗抑郁及抗焦慮)中發(fā)揮重要作用。其主要通過(guò)結(jié)合其受體酪氨酸受體激酶B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)進(jìn)而激活 PI3K/Akt(PKB)等信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。BDNF作為cAMP/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游CRE的表達(dá)產(chǎn)物之一，通過(guò)結(jié)合受體TrkB進(jìn)而激活PI3K/Akt(PKB)等信號(hào)通路也可在認(rèn)知增強(qiáng)、抗抑郁及抗焦慮中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。大量研究顯示GSK3作為BDNF下游調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶，受 PKB及蛋白激酶C的調(diào)控［19］。因此，cAMP/CREB/BDNF介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能對(duì)GSK3這一情緒調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子在抑郁癥及焦慮癥中發(fā)揮調(diào)控作用。本研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激誘導(dǎo)抑郁和焦慮樣行為的出現(xiàn)，動(dòng)物海馬內(nèi)p-CREB/BDNF及具有抑制性活性的絲氨酸殘基磷酸化GSK3(p-Ser21-GSK3α和p-Ser9-GSK3β)的表達(dá)均顯著下調(diào)，而具有增強(qiáng)GSK3活性的酪氨酸殘基磷酸化GSK3(p-Tyr279-GSK3α和p-Tyr216-GSK3β)、total GSK3α 和 total GSK3β 表達(dá)均未見(jiàn)顯著變化;進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)LiCl作為GSK3抑制劑顯著逆轉(zhuǎn)了慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的抑郁和焦慮樣行為，增強(qiáng)了 p-Ser21-GSK3α和 p-Ser9-GSK3β的表達(dá)，而未見(jiàn)對(duì) p-Tyr279-GSK3α、p-Tyr216-GSK3β、total GSK3α 和 total GSK3β 表達(dá)的影響，這提示LiCl作為GSK3抑制劑可能通過(guò)增強(qiáng)具有抑制GSK3活性的p-Ser21-GSK3α和p-Ser9-GSK3β的表達(dá)而對(duì)GSK3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抑制作用，這與Eom等［20］2009年的研究結(jié)果一致，且本研究未見(jiàn)LiCl對(duì)p-CREB及BDNF表達(dá)的增強(qiáng)作用。但是LiCl的作用僅僅通過(guò)上調(diào)具有抑制性的絲氨酸殘基磷酸化GSK3卻能顯著逆轉(zhuǎn)慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的行為學(xué)障礙，也證明了GSK3介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抑郁及焦慮癥發(fā)病中起關(guān)鍵性作用。進(jìn)一步分析PDE4抑制劑rolipram的作用發(fā)現(xiàn)，其不僅具有同LiCl相似的對(duì)GSK3信號(hào)通路的作用，而且顯著增強(qiáng)了p-CREB/BDNF的表達(dá)，并有顯著的抗抑郁及抗焦慮作用。這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明了一直被廣泛研究的rolipram抗抑郁及抗焦慮的作用可能不僅局限于通過(guò)p-CREB/BDNF信號(hào)通路，還可能通過(guò)下調(diào)GSK3介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮作用。因此，有必要通過(guò)過(guò)度激活GSK3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能否顯著削弱rolipram的作用來(lái)進(jìn)一步深入研究。我們的研究發(fā)現(xiàn)LiCl聯(lián)合rolipram用藥與單獨(dú)給予LiCl相比對(duì)p-Ser9-GSK3β的上調(diào)作用提高將近1倍，進(jìn)一步提示rolipram對(duì)p-Ser9-GSK3β的調(diào)節(jié)能力與GSK3抑制劑相似。

但是，PDE4抑制劑誘導(dǎo)的GSK3信號(hào)分子的改變與其介導(dǎo)的cAMP/PKA/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系如何，是否具有特異性的上下游關(guān)系值得關(guān)注。我們進(jìn)一步研究表明PKA阻斷劑H89顯著阻斷了rolipram對(duì)PKA/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上調(diào)作用，并且有效阻斷了rolipram對(duì)p-Ser9-GSK3β的上調(diào)作用，提示PKA/CREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)p-Ser9-GSK3β發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。另外，既然我們選擇PDE4抑制劑作為抗抑郁及抗焦慮癥的藥物作用靶標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭蠵DE4本身的活性是否發(fā)生變化決定了該藥物作用靶標(biāo)的特異性及有效性。我們的研究結(jié)果表明慢性應(yīng)激顯著提高了海馬內(nèi)PDE4D的表達(dá)，這可能是慢性應(yīng)激顯著下調(diào)pCREB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要原因之一。本研究中我們之所以選擇PDE4D進(jìn)行檢測(cè)，是因?yàn)镻DE4D在大腦皮層和海馬都有很高的分布［21］。與此相一致的是，PDE4D基因敲除小鼠皮層和海馬的PDE4活性降低達(dá)60%［22］，提示PDE4D有望成為抗抑郁及抗焦慮作用的有效藥物靶標(biāo)。

本研究中我們一直擔(dān)心，rolipram的致嘔吐作用是否會(huì)對(duì)行為學(xué)及動(dòng)物的精神狀態(tài)產(chǎn)生影響?我們的研究結(jié)果表明，隨著慢性應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)激組動(dòng)物體重顯著丟失，而LiCl與rolipram均逆轉(zhuǎn)了動(dòng)物體重的丟失。這一結(jié)果證實(shí)了rolipram的給藥并未因嘔吐反應(yīng)而影響動(dòng)物的攝食行為而影響動(dòng)物的體重。這一點(diǎn)得益于我們前期研究發(fā)現(xiàn)大鼠給予rolipram(1 mg/kg)后1 h其嘔吐反應(yīng)基本消失，且我們的行為學(xué)也選擇在給藥后1 h進(jìn)行，在一定程度上也減少了嘔吐反應(yīng)對(duì)行為學(xué)的影響，這一發(fā)現(xiàn)也得到其他學(xué)者研究結(jié)果的支持［9］。

我們的研究在應(yīng)激前與慢性應(yīng)激后均進(jìn)行了曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)以比較動(dòng)物的自主活動(dòng)能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激前各組動(dòng)物的自主活動(dòng)能力無(wú)顯著差異，但經(jīng)過(guò)25 d的慢性應(yīng)激后應(yīng)激組動(dòng)物自主活動(dòng)能力顯著減少，而LiCl及rolipram均顯著逆轉(zhuǎn)了這一效應(yīng)。自主活動(dòng)能力的減少是長(zhǎng)期慢性應(yīng)激的結(jié)果，恰恰證明了慢性束縛應(yīng)激穩(wěn)定誘導(dǎo)了動(dòng)物的情緒障礙。但是，還需考慮自主活動(dòng)能力是否會(huì)影響對(duì)動(dòng)物強(qiáng)迫游泳及高架十字迷宮的行為測(cè)試。事實(shí)上，我們強(qiáng)迫游泳中對(duì)動(dòng)物游泳時(shí)間的比較以及高架十字迷宮中對(duì)動(dòng)物穿越閉臂次數(shù)的比較均未見(jiàn)顯著差異，表明動(dòng)物在2個(gè)行為學(xué)測(cè)試中的自主活動(dòng)能力未受影響。這與曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)激誘導(dǎo)了動(dòng)物的自主活動(dòng)能力降低并不矛盾，可能因?yàn)閺?qiáng)迫游泳與高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)均是在一種較為危險(xiǎn)的環(huán)境下進(jìn)行的，而曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行2次，且環(huán)境較為溫和。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了PDE4抑制劑的抗抑郁及抗焦慮作用可能通過(guò)上調(diào)CREB/BDNF及下調(diào)GSK3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)發(fā)揮作用，為探索新型抗抑郁及焦慮共患病藥物新靶標(biāo)提供了思路。

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