鄭亞萍 韓 坤

漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生理教研室，河南 漯河 462002

心肌缺血再灌注損傷 （isehemia-reperfusioninjury，I/R）是心臟缺血性疾病及心外術(shù)后心肌損害的主要原因，其導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)。丹紅注射液是由丹參與紅花萃取制備而成，具有保護(hù)心血管的作用，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示丹紅注射液對(duì)大鼠離體心臟缺血再灌有保護(hù)作用[1]，但其對(duì)缺血再灌心肌細(xì)胞的直接作用的報(bào)道較少。本研究采用心肌細(xì)胞缺血再灌注細(xì)胞模型，觀察丹紅注射液預(yù)處理對(duì)其的影響，初步研究其作用的可能機(jī)制。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生2～3 d的SD大鼠。

1.2 試劑

丹紅注射液 （濟(jì)南步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)：Z20026866），胰蛋白酶、DMEM 培養(yǎng)基（均為 Sigma公司）；胎牛血清（杭州四季青公司），鼠抗橫紋肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體、抗Bcl-2、抗Bas（均為博士德公司），其余試劑均為市售分析純。

1.3 心肌細(xì)胞培養(yǎng)、鑒定

取2～3 d的SD大鼠，在無(wú)菌條件下取出心室，剪碎，0.1%胰酶消化，收集細(xì)胞，離心，重懸，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育。根據(jù)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞貼壁時(shí)間不同，采用差速貼壁1.5 h，獲得心肌細(xì)胞。免疫組化染色觀察α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白反應(yīng)。

1.4 缺血再灌注體外模型的建立

將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞更換無(wú)血清培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)箱（95%N2、5%CO2）中培養(yǎng)3 h后，置10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)9 h。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組

將心肌細(xì)胞按照2×105/mL均勻的接種于24孔板中，丹紅組分別以2%、4%、8%、16%的給藥濃度[1]，實(shí)驗(yàn)共分6組，每組5個(gè)孔，即：①正常對(duì)照組（用無(wú)胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液）；②缺血再灌注（I/R）組；③I/R+丹紅注射液（2%）組；④I/R+丹紅注射液（4%）組；⑤I/R+丹紅注射液（8%）組；⑥I/R+丹紅注射液（16%）組。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率

0.25 %胰蛋白酶消化各組心肌細(xì)胞，用4℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，離心5 min，重懸細(xì)胞，于70%冷乙醇（4℃）過(guò)夜。檢測(cè)時(shí)離心10 min（1 000 r/min），PBS洗去乙醇。細(xì)胞沉淀用碘化丙啶（PI）4℃避光染色30 min，上機(jī)檢測(cè)。G期前的亞二倍體峰即代表凋亡峰，反映凋亡細(xì)胞的百分比。

1.7 Bas、Bcl-2基因蛋白表達(dá)

各組心肌細(xì)胞爬片，固定，在室溫下用3%H2O2處理30 min以滅活過(guò)氧化物酶，后加入Bcl-2、Bax抗體4℃過(guò)夜，加入沖洗后依次加入1∶100生物素化山羊抗兔IgG和1∶100抗生物素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物液，DAB染色，復(fù)染，脫水，透明后封片。細(xì)胞漿顯示棕黃色顆粒細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，將玻片于光學(xué)顯微鏡下放大200倍，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞分布情況，每片選擇10個(gè)視野，每視野計(jì)算Bcl-2、Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，以平均計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占百分比作為Bcl-2、Bax蛋白蛋白陽(yáng)性表達(dá)指數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光鏡下心肌細(xì)胞鑒定結(jié)果

心肌細(xì)胞鑒定光鏡下觀察，心肌細(xì)胞接種72 h可見(jiàn)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭形，三角形或多邊形，單核，有多個(gè)偽足伸出，形成細(xì)胞簇；免疫組化染色顯示，α-橫紋肌肌動(dòng)蛋白呈陽(yáng)性反應(yīng)，陽(yáng)性率達(dá)90%以上。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，缺血再灌組細(xì)胞凋亡率表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與I/R組比較，用丹紅注射液預(yù)處理后呈濃度依賴性地下調(diào)凋亡率 （P＜0.05或P＜ 0.01）。 見(jiàn)表 1。

表1 丹紅注射液對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響（，%）

表1 丹紅注射液對(duì)心肌細(xì)胞凋亡率的影響（，%）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與I/R組比較，#P＜0.05，##P ＜ 0.01

組別 心肌細(xì)胞凋亡率正常對(duì)照組（n=5）I/R 組（n=5）I/R+丹紅注射液（2%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（4%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（8%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（16%）組（n=5）6.12±1.25 54.18±9.26**42.23±3.57**#36.19±3.82**#29.33±2.85**##19.45±2.53*##

2.3 Bas、Bcl-2 蛋白的表達(dá)

結(jié)果顯示，缺血再灌組細(xì)胞Bas表達(dá)明顯高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)則顯著低于對(duì)照組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）；而與I/R組相比，用丹紅注射液預(yù)處理后呈濃度依賴性的下調(diào)凋亡率及Bas表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）。見(jiàn)表2。

3 討論

缺血心肌的早期再灌注治療能減輕缺血損傷，使細(xì)胞凋亡下降，減小梗死面積，缺血較長(zhǎng)時(shí)間后再灌注反而會(huì)引起再灌注損傷，造成細(xì)胞凋亡明顯增加，因而心肌細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是再灌注損傷的重要環(huán)節(jié)[2]。丹紅注射液目前已用于臨床治療冠心病，且對(duì)離體大鼠缺血再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用，此作用可能與抑制心肌脂質(zhì)過(guò)氧化、增強(qiáng)抗氧化能力及調(diào)控凋亡基因有關(guān)[3]。

表2 丹紅注射液對(duì)心肌細(xì)胞Fas、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響（，%）

表2 丹紅注射液對(duì)心肌細(xì)胞Fas、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響（，%）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與I/R組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 Bas蛋白 Bcl-2蛋白正常對(duì)照組（n=5）I/R 組（n=5）I/R+丹紅注射液（2%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（4%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（8%）組（n=5）I/R+丹紅注射液（16%）組（n=5）5.85±0.94 31.12±5.39**25.46±4.25**#22.14±3.98**#18.45±3.13**##9.45±2.44*##46.45±6.87 13.08±4.26**19.52±5.12**#24.35±4.89**#30.34±3.73*#36.14±3.97*##

Bcl-2、Bas基因家族是目前較為公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因，Bcl-2基因可抑制許多因素引起的細(xì)胞凋亡，被稱為細(xì)胞凋亡抑制基因，Bas單克隆抗體在體內(nèi)與Bas結(jié)合后均能導(dǎo)致表達(dá)Bas的細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而證明Bas是一種識(shí)別Bas配體，并將凋亡信息傳遞給細(xì)胞的細(xì)胞表面受體[4-5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血再灌能促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，且伴隨著B(niǎo)cl-2基因表達(dá)蛋白的明顯降低和Bas基因表達(dá)蛋白的明顯升高；而丹紅注射液則能呈濃度依賴性地下調(diào)心肌細(xì)胞的凋亡率，并伴有Bcl-2基因表達(dá)蛋白的上調(diào)和Bas基因表達(dá)蛋白的下調(diào)。

大鼠心肌缺血再灌注過(guò)程中，Bcl-2蛋白表達(dá)減少而B(niǎo)as蛋白表達(dá)增加，表明心肌細(xì)胞凋亡可能是一方面Bcl-2蛋白表達(dá)降低，抗凋亡能力減弱，而另一方面Bas蛋白表達(dá)增加，發(fā)揮了促凋亡能力的緣故[6]。丹紅注射液則可通過(guò)上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)的和下調(diào)Bas蛋白表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)缺血再灌心肌細(xì)胞的作用，這也為臨床上應(yīng)用丹紅治療心肌缺血再灌注損傷提供分子調(diào)控依據(jù)。

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