李維娜 楊繼慶* 劉淵聲 文 峻 翟明明 屈學民

肺癌是最近50年以來全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率增長最快的惡性腫瘤，目前在很多世界發(fā)達國家和部分發(fā)展中國家已排到惡性腫瘤的第一位[1-2]，其治療手段主要有手術(shù)療法、化學療法、放射療法和新近出現(xiàn)的分子靶向療法[3-4]等。盡管各種治療手段均有很大進步，但5年生存率仍＜15%[5]。因此，如何更有效的治療肺癌成為當今研究的熱點。

光動力學療法(photodynamic therapy，PDT)是一種新的腫瘤治療手段，具有快速起效、毒性較低和治療創(chuàng)傷小等優(yōu)點，在癌癥治療方面有著非常廣泛的應用。本實驗研究鋅酞氰(Zinc Phthalocyanine,ZnPc)介導的光動力學療法(ZnPc-PDT)對小鼠Lewis肺癌細胞的影響，探索了ZnPc-PDT殺傷Lewis肺癌細胞的最佳工作參數(shù)，為后期的動物體內(nèi)實驗提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗細胞

小鼠Lewis肺癌細胞株：由第四軍醫(yī)大學遺傳與發(fā)育教研室惠贈，常規(guī)復蘇，傳代接種后，取其生長良好的第三代細胞完成本次實驗。

1.2 主要試劑和儀器

ZnPc購自上海TCI公司，在暗室中稱取ZnPc粉末11.5 mg，加入二甲基亞砜(DMSO)溶劑10 mL，待充分溶解后，避光分裝后-20 ℃避光保存，添加DMSO配制成所需的不同濃度的溶液即可。四甲基偶氮唑鹽(MTT)購自美國Sino-American Biotec公司，以磷酸鹽緩沖液(PBS)配制MTT溶液5 mg/mL；過濾除菌，分裝后避光-20 ℃保存。本實驗還用到中國臺灣BD Bioscience公司的凋亡試劑盒Annexin V/PI，培養(yǎng)基RMPI 1640等。

應用的主要儀器有670 nm DL-Y半導體激光治療儀(第四軍醫(yī)大學數(shù)理教研室研制)，光功率計(LM-91C型)，紫外分光光度計(日本HITACHI公司),酶標儀(北京東勝創(chuàng)新公司)，流式細胞儀(美國BD Bioscience公司)等。

1.3 MTT檢測法

接種小鼠Lewis肺癌細胞1×105個于96孔板內(nèi)，加入光敏劑，4 h后進行光照；避光孵育12 h后每孔加入10 μl MTT溶液，恒溫孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)基，加入100 μl DMSO，避光搖動混勻15 min；酶標儀測量492 nm處吸光度值。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

接種小鼠Lewis肺癌細胞2×104個于24孔板內(nèi)，加入光敏劑，4 h后進行光照；避光孵育12 h后收集所有貼壁和懸浮細胞，用流式細胞儀進行分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對數(shù)據(jù)進行處理和分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 ZnPc的光譜特性分析

利用分光光度計分別檢測了ZnPc的吸收峰。如圖1所示，ZnPc的吸收峰出現(xiàn)在670 nm處，因此本實驗選擇輸出波長為670 nm的激光器激發(fā)ZnPc。

2.2 光敏劑濃度對Lewis細胞殺傷作用的影響對比研究

接種小鼠Lewis肺癌細胞于96孔板，加入ZnPc和溶液，濃度調(diào)節(jié)到0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L，避光培養(yǎng)4 h，然后在暗室中用670 nm的激光光照5 min，激光能量密度均為120 mW/cm2。

圖1 ZnPc的吸收峰

2.2.1 用MTT檢測法檢測PDT對細胞增殖的變化

用MTT法檢測ZnPc-PDT對小鼠Lewis細胞的抑制率，用吸光度A492nm表示細胞的存活率(見表1)。

由表1數(shù)據(jù)可知，隨著ZnPc濃度水平的增加，Lewis細胞在492 nm處的吸光值逐漸減小。利用t檢驗對相鄰濃度的兩組光敏劑分別進行比較可知，15 μmol/L和10 μmol/L時作用效果無顯著性差異(t=1.739，P＞0.05)，其他相鄰濃度水平間均存在顯著性差異。

2.2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

加入ZnPc使?jié)舛确謩e達到10 μmol/L和20 μmol/L進行PDT處理，將經(jīng)過ZnPc介導的PDT處理后的小鼠Lewis肺癌細胞，用流式細胞儀檢測，左上角表示壞死細胞所占比例，右上角表示晚期凋亡細胞所占比例，左下角表示活細胞所占比例，右下角表示早期凋亡細胞所占比例(如圖2所示)。

圖2 不同濃度時流式細胞術(shù)分析結(jié)果

由圖2顯示，隨著光敏劑濃度的增加，活細胞所占的比例逐漸減小。光敏劑濃度為0時，活細胞所占比例為87.78%；光敏劑濃度為10 μmol/L的ZnPc-PDT時活細胞所占比例為38.93%；光敏劑濃度為20 μmol/L的ZnPc-PDT時活細胞所占比例為26.24%，說明ZnPc介導的PDT的作用效果均比較明顯，ZnPc-PDT在低濃度為10 μmol/L時即有較強的殺傷效果。

表1 濃度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

表1 濃度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

5 μmol/L和0 μmol/L比較，P=0.003； 10 μmol/L和5 μmol/L比較，P=0.001；15 μmol/L和10 μmol/L比較，P=0.133； 15 μmol/L和20 μmol/L比較，P=0.014

表2 光照時間對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

表2 光照時間對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

1 min與0 min比較，P=0.000； 2 min與1 min比較，P=0.001；3 min與2 min比較，P=0.039； 5 min與3 min比較，P=0.303

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表3 功率密度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

表3 功率密度對ZnPc介導的PDT對細胞殺傷效果的影響(n=4，)

30 mW/cm2與0 mW/cm2比較，P=0.000； 60 mW/cm2與30 mW/cm2比較，P=0.001；90 mW/cm2與60 mW/cm2比較，P=0.082； 120 mW/cm2與90 mW/cm2比較，P=0.540

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2.3 光照時間對Lewis細胞殺傷作用的對比研究

接種小鼠Lewis肺癌細胞于96孔板，加入ZnPc溶液，濃度為20 μmol/L，避光培養(yǎng)4 h，然后在暗室中分別用635 nm和670 nm的激光光照0 min、1 min、2 min、3 min、5 min，激光能量密度均為120 mW/cm2。

2.3.1 用MTT檢測法檢測PDT對細胞增殖的變化

用吸光度A492nm表示細胞的存活率，比較0 min、1 min、2 min、3 min、5 min兩種光敏劑對細胞的殺傷效果見表2。

由表2數(shù)據(jù)可知，隨著光照時間的增強，ZnPc介導的PDT對小鼠Lewis肺癌細胞的殺傷作用逐漸增強，表現(xiàn)為492 nm處的吸光度值在逐漸減小。當光照時間為0 min、1 min、2 min、3 min時相鄰兩組間t值分別為12.68，6.257，2.631，P值均＜0.05，不同時間段的作用效果存在顯著性差異；5 min和3 min時t=1.126，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義，作用效果無顯著性差異。隨著照射時間的增長，PDT對細胞的殺傷作用逐漸增強，但當時間達到一定值后則失去統(tǒng)計學意義。

2.3.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

圖3 不同光照時間時流式細胞術(shù)分析結(jié)果

將經(jīng)過ZnPc-PDT處理后的小鼠Lewis肺癌細胞，用流式細胞儀檢測結(jié)果如圖3所示。在進行ZnPc-PDT時，光照時間為0時，活細胞所占比例為88.62%；光照時間為2 min的ZnPc-PDT時活細胞所占比例為46.23%，5 min時活細胞所占比例為26.24%。說明ZnPc-PDT對Lewis肺癌細胞的殺傷效果明顯，ZnPc-PDT在光照2 min時即有較強的殺傷效果。

2.4 光源功率密度對小鼠Lewis肺癌細胞殺傷作用的對比研究

接種小鼠Lewis肺癌細胞于96孔板，加入ZnPc溶液，濃度20 μmol/L，避光培養(yǎng)4 h，然后在暗室中分別用635 nm和670 nm的激光光照5 min，激光能量密度分別為0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2。

2.4.1 用MTT檢測法檢測ZnPc-PDT對細胞增殖的變化

用吸光度A492nm表示細胞的存活率，比較激光能量密度分別為0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2時，兩種光敏劑對細胞的殺傷效果見表3。

由表3數(shù)據(jù)可知，隨著功率密度的增強，ZnPc-PDT對Lewis細胞的殺傷作用均逐漸增強。當激光功率密度為0 mW/cm2、30 mW/cm2、60 mW/cm2時，相鄰組間t=9.059,5.812，P＜0.05，不同功率密度的作用效果存在顯著性差異；當激光功率密度為60 mW/cm2、90 mW/cm2、120 mW/cm2時，相鄰組間t=2.085,0.6505，P＞0.05，無統(tǒng)計學意義，作用效果無顯著性差異。隨著功率密度的增強，PDT對細胞的殺傷作用逐漸增強，但當功率密度大到60 mW/cm2后則失去統(tǒng)計學意義，可能因殺傷能力已趨于飽和。

2.4.2 用流式細胞儀檢測細胞凋亡

將經(jīng)過ZnPc-PDT處理后的小鼠Lewis肺癌細胞，用流式細胞儀檢測結(jié)果如圖4所示。光功率密度為0時，活細胞所占比例為91.09%，光功率密度為60 mW/cm2時ZnPc-PDT活細胞所占比例為40.31%，120 mW/cm2時活細胞所占比例為26.24%。說明ZnPc-PDT的作用效果比較明顯，在功率密度為60 mW/cm2時即有較強的殺傷效果。

圖4 不同功率密度時流式細胞術(shù)分析結(jié)果

3 討論

目前，利用PDT治療肺癌方面的研究多以血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative，HPD)為光敏劑[6-8]，而HPD作為一代光敏劑的代表，雖然有著廣泛的應用，但其組織選擇性較差，光毒性較強，避光時間較長等缺點成為制約其發(fā)展的主要原因[9-10]。ZnPc屬于二代光敏劑，具有避光時間短，代謝速度快，組分單一等特點，目前已在臨床上廣泛應用，而關(guān)于其在肺癌方面的研究還未見報道[11-12]。

本實驗通過光譜分析可知光敏劑ZnPc的峰值單一，吸收峰波長為670 nm，說明其組分單一，不良成分較少；波長較長，對組織的穿透能力較強。在研究ZnPc-PDT中其濃度對小鼠Lewis肺癌細胞的殺傷作用時利用MTT法和流式細胞技術(shù)均顯示，PDT的療效在一定范圍內(nèi)隨光敏劑濃度的增加而增強，但增強到一定值(10 μmol/L)以后相鄰濃度不具有顯著性差異，可能是由于殺傷能力已達到飽和。流式細胞技術(shù)顯示，ZnPc-PDT在低濃度(10 μmol/L)時即有較強的殺傷效果。

在研究光照時間對Lewis肺癌細胞的殺傷作用時，同樣MTT法和流式細胞技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，PDT的療效在一定范圍內(nèi)隨光照時間的增加而增強，MTT法顯示當兩者光照時間為3 min和5 min時，t=1.126，P＞0.05，不具備統(tǒng)計學意義，說明作用效果無顯著性差異，可能是殺傷能力已達到了飽和。流式細胞技術(shù)顯示兩種光敏劑介導的PDT的作用效果均比較明顯，ZnPc-PDT在光照2 min時即有較強的殺傷效果。在研究激光功率密度對ZnPc介導的PDT對Lewis肺癌細胞的殺傷作用時，MTT法和流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示對于同一種光敏劑，PDT的療效在一定范圍內(nèi)隨光源功率密度的增加而增強，MTT法顯示兩種光敏劑在能力密度達到60 mW/cm2以后，相鄰光強下的細胞殺傷能力不具備統(tǒng)計學意義，可能是光敏化能力已趨于飽和。ZnPc-PDT在低功率密度下(60 mW/cm2)即有較強的殺傷效果。

以上結(jié)果表明，ZnPc-PDT對Lewis肺癌細胞的殺傷作用隨光敏劑濃度、光照時間、光源功率密度的增加而增強，但增強到一定值后會趨于飽和；并且由ZnPc的譜線圖可知，ZnPc的波峰相對單一即說明其成分單一，對細胞的毒副作用相對較小；ZnPc的波長較長，因此其對組織的穿透能力更強。研究初步表明，在肺癌方面ZnPc-PDT是一種高效，低不良反應的治療方法，但需要在下一步的動物體內(nèi)實驗進行驗證。

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