任小宇，孫桂波，張 強(qiáng)，徐惠波，孫曉波

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040;2.遼東學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)部，遼寧丹東 118003;3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193;4.溫州醫(yī)學(xué)院，浙江溫州 325035;5.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春 130011)

三七是五加科多年生人參屬植物，具有止血祛淤、消腫止痛的功效。傳統(tǒng)中醫(yī)多以根入藥。其主要活性成分為皂苷類成分。近年來因三七的價(jià)格增長過快，使以三七根莖為原料的制劑均出現(xiàn)成本難以控制、企業(yè)難以承受的局面。但市場對三七入藥的產(chǎn)品需求卻不斷增加，因此，綜合利用和開發(fā)三七各活性部位對充分研發(fā)和利用三七具有重要意義。三七莖葉是三七的活性部位。其主要活性成分三七莖葉皂苷(panex notoginsegnoside of the leaves，PnGL)屬于達(dá)瑪烷型三萜皂苷。與傳統(tǒng)入藥部位三七根皂苷相比，藥理活性、作用相似［1］，但所含化學(xué)成分卻差別迥異。對三七莖葉的化學(xué)研究表明，其主要含有原人參二醇型皂苷，幾乎不含原人參三醇型皂苷，這是與三七主根皂苷的最大不同點(diǎn)。另外，三七莖葉具有資源豐富、來源廣泛、價(jià)格低廉的特點(diǎn)。利用三七莖葉皂苷，現(xiàn)在我們已開發(fā)了一種對腦血管疾病有治療作用的五類新藥，正在開展三期臨床實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步深入研究PnGL在心血管方面的藥理作用對三七的綜合利用開發(fā)具有重要意義。目前，文獻(xiàn)報(bào)道表明，PnGL在鎮(zhèn)靜、抗炎等方面具有明顯的藥理活性［2－3］，但其在心血管藥理方面報(bào)道鮮見。本實(shí)驗(yàn)選用 Langendorff離體灌流技術(shù)，觀察PnGL對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型的影響，旨在為PnGL的研究和開發(fā)及抗心肌缺血藥物的探索提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 選用SPF級SD大鼠，♂，體質(zhì)量330～380 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。合格證號:SCXK(京)2006-2009。

1.2 藥品和試劑 PnGL:棕黃色粉末，由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院提供。臨用前溶于K-H液中配成所需濃度。K-H液成分如下(g·L－1):NaCl 6.8912、NaHCO32.09、KCl 0.35015、KH2PO40.1606、GLU l.998、MgSO4·7H2O 0.2908、CaCl20.283，pH 7.4。地奧心血康，成都地奧制藥集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，批號Z10910051。乳酸脫氫酶、肌酸激酶、SOD、MDA、GSH-Px試劑盒購自南京建成生物醫(yī)學(xué)工程研究所。

1.3 儀器 美國Radnoti離體灌流系統(tǒng);成都泰盟BL-420/820四道生理記錄儀;天津奧特賽恩斯AP-01P型真空泵;梅特勒pH計(jì)。DY89-Π型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī);MQX200型酶標(biāo)儀;TGL-16高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)。

1.4 方法

1.4.1 離體心臟Langendorff灌流模型制備 SD大鼠經(jīng)20%烏拉坦(腹腔注射)麻醉后，舌下靜脈注射肝素鈉(25 mg·kg－1)行肝素化。迅速開胸，取心臟，懸掛于Langendorff灌流裝置上，以恒溫(37℃)，充二元氧(95%O2，5%CO2)，K-H液持續(xù)逆流灌流，流速為10 ～15 ml·min－1。采用左心室內(nèi)水囊傳遞壓力測定心室內(nèi)壓，通過BL-420生物信號采集系統(tǒng)記錄左室收縮曲線，計(jì)算左心室各項(xiàng)心功能指標(biāo)，包括左室收縮壓(LVSP)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(－dp/dtmax)。

1.4.2 PnGL對缺血/再灌注損傷模型的影響 SD大鼠36只，隨機(jī)分為6組(n=6)，分別是空白對照組、模型組、陽性給藥組(地奧心血康 70 mg·kg－1)、PnGL 低、中、高劑量組(20、40、80 mg·kg－1)。陽性給藥組和PnGL給藥組大鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d，空白對照組和模型組同時(shí)給予同體積生理鹽水。末次給藥60 min后，分離心臟置于Langendorff離體灌流裝置上，各組心臟平衡15 min后，缺血/再灌注(I/R)組;陽性給藥組(地奧心血康);PnGL低、中、高劑量組(20、40、80 mg·L－1)，全心停灌25 min，再灌注 60 min，造成心肌缺血/再灌注損傷模型。正常對照組心臟平衡后持續(xù)灌流85 min。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的測定 在左心耳根部剪一小口，從此處插入球囊(接BL/420信號采集系統(tǒng))至左心室記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，實(shí)時(shí)記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):LVSP、LVDP、±dp/dtmax、HR。

1.5.2 冠脈流出液中LDH、CK的測定 再灌注60 min時(shí)取灌流液于－80℃凍存待測。標(biāo)本收集后用生化試劑盒測定其活性。

1.5.3 心肌組織中 SOD、GSH-Px活性、MDA 含量及LDH，CK活性檢測 灌流完畢后取下心臟，于－80℃凍存，標(biāo)本收集后用相應(yīng)生化試劑盒測定其活力和含量。

1.6 病理組織學(xué)觀察心肌損傷程度 取出心臟，用4%多聚甲醛液固定，制成石蠟切片，從心尖至心底連續(xù)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

Tab 1 Effects of PnGL on isolated cardiac function recovery rate(reperfusion for 60min)in rats(±s，n=6)

Tab 1 Effects of PnGL on isolated cardiac function recovery rate(reperfusion for 60min)in rats(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs normal;#P＜0.05 vs model

Group Reperfusion 60 min recovery rate/%LVSP LVDP +dp/dt －dp/dt HR Normal control 87.09 ±12.6 84.94 ±13.1 93.98 ±14.7 86.20 ±12.0 98.98 ±7.07 Model 76.28 ±9.69 37.20 ±9.37＊＊ 34.09 ±8.14＊＊ 32.91 ±10.1＊＊ 62.62 ±15.0＊＊Positive drug 78.09 ±11.3 70.31 ±13.8## 68.44 ±12.9## 65.07 ±11.1# 80.39 ±15.7 Low 70.00 ±17.6 49.59 ±10.7 58.16 ±11.5 52.96 ±12.3 65.92 ±18.0 Middle 73.13 ±26.0 55.64 ±11.9 65.08 ±13.3# 62.79 ±14.5# 80.85 ±14.3 High 89.84 ±16.9 84.49 ±18.6## 82.85 ±20.5## 73.08 ±19.3##84.27 ±20.7

Tab 2 Effect of PnGL on LDH and CK release in perfusate and myocardial tissue after I/R injury

2 結(jié)果

2.1 PnGL對大鼠離體缺血/再灌注心肌血流動(dòng)力學(xué)的影響 各組大鼠離體心臟在I/R前平衡時(shí)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。再灌注60 min時(shí)，與空白組比較，模型組LVDP、±dp/dtmax明顯下降(P＜0.05)。與模型組比較，陽性給藥組、PnGL高、中劑量組上述指標(biāo)均有明顯改善。提示:PnGL可明顯改善受損心肌的舒縮功能，降低I/R損傷對心肌舒縮功能的抑制作用。見Tab 1。

2.2 PnGL對大鼠離體缺血/再灌注心臟組織和冠脈流出液中LDH、CK活性的影響 與空白組比較，模型組心肌組織中LDH、CK的活性明顯降低，差異具有顯著性(P＜0.05);而灌流液中LDH、CK的活性明顯增高，差異具有顯著性(P＜0.05)。與模型組比較，陽性藥組再灌注后60 min組織中LDH、CK活性增高(P＜0.05);灌流液中LDH、CK活性降低(P＜0.05)。PnGL高、中、低3個(gè)劑量組再灌注后60 min組織中LDH、CK活性增高(P＜0.05);灌流液中LDH、CK活性降低(P＜0.05)。提示PnGL通過增強(qiáng)心肌細(xì)胞膜穩(wěn)定性而降低缺血/再灌注心肌的損傷，發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。結(jié)果見Tab 2。

2.3 PnGL對離體大鼠缺血/再灌注心肌組織SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響 與空白組比較，缺血/再灌注模型組心肌組織中SOD、GSHPx活性下降(P＜0.01)，MDA含量增加(P＜0.01)。與模型組比較，陽性給藥組和PnGL中、高兩個(gè)劑量組 SOD、GSH-Px活性增加，MDA含量降低，并呈一定量效關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。提示PnGL可提高缺血/再灌注心肌組織中SOD、GSH-Px活性、降低MDA含量，增強(qiáng)心肌的抗氧化能力。見Tab 3。

Tab 3 Effects of PnGL on the content of MDA，SOD and GSH-Px activities in myocardial tissue after I/R

2.4 HE染色光學(xué)顯微鏡觀察心肌結(jié)構(gòu) 顯微鏡下觀察:正常對照組:心肌組織結(jié)構(gòu)基本無異常，心肌細(xì)胞排列比較整齊，橫紋比較清楚(Fig 1A)。I/R組:心肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)多處斷裂，間質(zhì)增寬、水腫，局部呈現(xiàn)波浪形，可見多處變性壞死灶，程度較重，胞質(zhì)有溶解現(xiàn)象，壞死心肌肌漿呈嗜伊紅染的條帶或斑塊，心肌纖維間可見大量炎細(xì)胞浸潤(Fig 1B)。陽性給藥組:心肌纖維排列紊亂，可見變性壞死灶，但程度較輕，心肌纖維間可見少量炎細(xì)胞浸潤(Fig 1C)。PnGL高劑量組:可見輕度心肌纖維變性壞死灶，心肌纖維間可見少量炎性細(xì)胞浸潤(Fig 1D)。

Fig 1 Effect of PnGL on isolated myocardial ischemia-reperfusion injury of rats (HE×400)

3 討論

心肌缺血/再灌注可造成多種損傷后果，包括心臟舒縮功能抑制、細(xì)胞膜受損、心肌組織壞死等，其機(jī)制涉及自由基損傷及炎癥反應(yīng)等［4］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌缺血/再灌注60min后，模型組心肌舒縮功能嚴(yán)重受限，LVSP、LVDP、±dp/dt均明顯下降。PnGL預(yù)防性給藥后，高劑量組心功能上述指標(biāo)恢復(fù)明顯、效果顯著。心肌缺血/再灌注損傷可通過多種因素造成心肌細(xì)胞破損，細(xì)胞膜通透性增加，繼而使細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)志性心肌酶LDH、CK外漏致血清或灌流液中，同時(shí)造成心肌組織內(nèi)酶活性降低［5］。本實(shí)驗(yàn)酶學(xué)指標(biāo)顯示，PnGL高劑量組酶學(xué)改變明顯減輕(LDH、CK，P＜0.05)，提示預(yù)先給藥PnGL可提高心肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少酶的外漏，繼而有效的保護(hù)心肌細(xì)胞。

心肌缺血/再灌注過程中大量氧自由基的生成是引起心肌缺血/再灌注損傷的主要機(jī)制之一［6］。大量的氧自由基生成可引起多種生物靶點(diǎn)的損傷，如蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等，并可通過過氧化反應(yīng)造成嚴(yán)重的生物膜損害，以及后續(xù)的細(xì)胞損傷或者死亡［7－9］。機(jī)體存在 SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)。SOD能催化超氧自由基歧化為過氧化氫，繼而在GSH-PX作用下使過氧化氫降解為水和氧氣［10］。MDA的含量常常可反映機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映心肌細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度和細(xì)胞損傷的程度［11］?？寡趸到y(tǒng)防御能力的增強(qiáng)有利于減輕組織氧化損傷，能有效保護(hù)組織細(xì)胞。PnGL可提高心肌組織中SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。表明PnGL可能通過清除氧自由基起到保護(hù)心肌的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，早期炎癥反應(yīng)是加重心肌損傷的重要因素之一［12］。另外，能否縮小心肌壞死面積或減輕心肌壞死程度是評價(jià)藥物對缺血性心肌病療效的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)HE染色結(jié)果顯示，模型組心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，可見多處變性壞死灶，胞質(zhì)出現(xiàn)溶解，程度較重，心肌纖維間可見大量炎細(xì)胞浸潤。預(yù)防性給予PnGL后，與模型組比較，PnGL高劑量組心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂現(xiàn)象明顯減輕，斷裂、彎曲現(xiàn)象減少。壞死灶明顯縮小，壞死程度明顯減輕。間質(zhì)中炎細(xì)胞浸潤明顯減少，炎癥反應(yīng)明顯減弱。染色結(jié)果表明，預(yù)防性給予PnGL對缺血/再灌注心肌組織具有明顯的保護(hù)作用。

綜上所述，預(yù)防性給予PnGL能減輕心肌再灌注所造成的多種損傷，其對心肌組織的保護(hù)作用可能是多方面的。既可減輕由缺血/再灌注導(dǎo)致的心功能抑制，減少標(biāo)志性心肌酶的釋放，又可降低心肌組織變性壞死程度，減少炎細(xì)胞的浸潤。其保護(hù)機(jī)制部分可能與抗自由基損傷有關(guān)，但其確切的作用機(jī)制有待于多方面、多層次的深入研究，尤其是研究其對抗心肌缺血/再灌注損傷的作用靶點(diǎn)及相關(guān)的信號通路，將對進(jìn)一步揭開PnGL心肌保護(hù)的作用機(jī)制具有重要意義。

［1］ 周家明，崔秀明，曾鴻超，等.三七莖葉的綜合開發(fā)利用［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2009，23(3):32.

［1］ Zhou J M，Chui X M，Zeng H C，et al.Comprehensive development and utilization of Panax notoginsegnoside of leaves［J］.Res Pract Chin Med，2009，23(3):32.

［2］ 葉豆丹.三七葉的臨床應(yīng)用［J］.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，23(4):104.

［2］ Ye D D.Clinical application of Panax notoginsegnoside of leaves［J］.J Changchun Univ Tradit Chin Med，2007，23(4):104.

［3］ 李淑惠，李曉輝，張海港，等.三七葉皂苷抗炎作用機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究［J］.哈爾濱商業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，18(1):30－2.

［3］ Li S H，Li X H，Zhang H G，et al.Experimental study of anti-inflammatory mechanism of Panax notoginsegnoside of leaves［J］.J Harbin Univ Commer，2002，18(1):30 －2.

［4］ 欒榮華，馬梃光，區(qū)晉禧，等.降鈣素基因相關(guān)肽對阿霉素心肌細(xì)胞毒性的保護(hù)作用［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，1998，14(3):29－31.

［4］ Luan R H，Ma T G，Ou J X，et al.The protective role of calciton in gene related peptide against adriamycin-induced acute cadiotoxicity in cultured myocardial cells［J］.Chin Pharmacol Bull，1998，14(3):29－31.

［5］ Kaur H，Parikh V，Sharma A，Singh M.Effect of amiloride A Na+/H+exchange inhibitor on cardioprotective effect of ischaemic preconditioning:possible involvement of resident cardiac mast cells［J］.Pharmacol Res，1997，36(2):95 －102.

［6］ Rajadurai M，Stanely Mainzen Prince P.Preventive effect of naringin on lipid peroxides and antioxidants in isoproterenol-induced cardiotoxicity in Wistar rats:biochemical and histopathological evidences［J］.Toxicology，2006，228(2-3):259 － 68.

［7］ Duranteau J，Chandel N S，Kulisz A，et al.Intracellular signaling by reactive oxygen species during hypoxia in cardiomyocytes［J］.Biol Chem，1998，273(19):11619－24.

［8］ Hensley K，Robinson K A，Gabbita S P，et al.Reactive oxygen species，cell signaling，and cell injury［J］.Free Radical Biol Med，2000，28(10):1456－62.

［9］ Basaga H S.Biochemical aspects of free radicals［J］.Biochem Cell Biol，1990，68(7-8):989 －98.

［10］張榮沭，沈雅香，苗 術(shù)，等.槲寄生黃酮苷對大鼠心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30(12):1001.

［10］ Zhang R S，Shen Y X，Miao S，et al.The protective role of Mistletoe flavonoid glycosides on myocardial ischemia-reperfusion injury in rat［J］.Chin J Hosp Pharm，2010，30(12):1001.

［11］呼敏鳳，尚立芝，韋大文.川芎嗪預(yù)處理對心肌缺血/再灌注損傷大鼠保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.上海中醫(yī)藥雜志，2008，42(4):66.

［11］ Hu M F，Shang L Z，Wei D W.The protective role of ligustrazine pretreatment on on myocardial ischemia-reperfusion injury in rat［J］.Shanghai J Trad Chin Med，2008，42(4):66.

［12］ Entman M L，Youker K A，F(xiàn)rangogiannis N，et al.Is inflammartion good for the ischemic heart-perspectives beyond the ordinary［J］.Z Kardiol，2000，89(Suppl 9):I X/82 －7.