姚志文 劉 唯 程由勇 李紅玖 李春華 于大海

1.廣州醫(yī)學(xué)院附屬深圳沙井醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518104；2.廣西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530021021

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）能促進(jìn)舌癌（carcinoma of tongue）中血管的生成，與舌癌的生長與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1-2]，抑制VEGF基因的表達(dá)可望抑制舌癌血管的生成，從而抑制舌癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。本研究以VEGF基因為靶點，構(gòu)建VEGF-siRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細(xì)胞，研究其對Tca8113細(xì)胞VEGF基因表達(dá)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

Tca8113細(xì)胞株（四川大學(xué)口腔疾病研究國家重點實驗室），Psilencer 2.1-U6-neo真核表達(dá)載體（美國 Ambion公司），脂質(zhì)體 Lipofectamine 2000（美國 Invitrogen 公司），質(zhì)粒小劑量提取試劑盒（美國Omega公司），大腸桿菌DH5α（武漢晶賽生物公司），G418試劑（美國Gbico公司），人VEGFELISA試劑盒 （上海森雄科技實業(yè)有限公司），限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 （美國NEB公司），HRP標(biāo)記兔抗人的IgG抗體（美國Gbico公司），鼠抗人VEGF的單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子基因特異的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫已知VEGF mRNA序列，參考siRNA的設(shè)計有關(guān)文獻(xiàn)[3]，設(shè)計針對VEGF基因不同剪切子的公共靶點，根據(jù)所選靶點人工合成VEGF基因RNAi靶序列（5′-GATAGAGCAAGACAAGAAA-3′）及其互補(bǔ)的反義鏈。以及一條實驗對照序列（即無關(guān)序列HK：5′-GACTTCATAAGGCGCATGC-3'）及其互補(bǔ)的反義鏈。靶序列和實驗對照序列各自的互補(bǔ)兩條寡核苷酸片段經(jīng)退火連接形成雙鏈DNA模板鏈。用Bam HI+HindⅢ對質(zhì)粒Psilencer 2.1-U6-neo進(jìn)行雙酶切。T4 DNA連接酶將線性化Psilencer 2.1-U6-neo和模板鏈連接成重組載體，靶序列與實驗對照序列重組載體分別命名為Pu-VEGF-siRNA載體和Pu-HK載體。

1.2.2 重組載體的酶切和測序 重組的Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK載體轉(zhuǎn)化感受態(tài) DH5α 細(xì)菌，50μg/mL的 Ampr抗性LB培養(yǎng)皿篩選陽性克隆，質(zhì)粒提取試劑盒按說明提取重組載體。SalⅠ酶切重組載體，測序鑒定。

1.2.3 重組載體的轉(zhuǎn)染 10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。以每孔1×106/mL細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板并培養(yǎng)過夜。按說明書使用Lipofectamine 2000將含有重組Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK載體分別轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞。實驗分為三組，轉(zhuǎn)染Pu-VEGF-siRNA為實驗組，轉(zhuǎn)染Pu–HK載體組作實驗對照組，未轉(zhuǎn)染組作空白對照組。實驗組和實驗對照組G418篩選1周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆。

1.2.4 免疫組織化學(xué)染色分析Tca8113細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白表達(dá) 常規(guī)SABC法檢測Tca8113細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)，各組隨機(jī)選取100個Tca8113染色細(xì)胞，使用MIAS－2000醫(yī)用彩色病理圖像免疫組化測量系統(tǒng)對其灰度值進(jìn)行測定。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）測定Tca8113細(xì)胞上清液的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白表達(dá) 按照ELISA試劑盒操作說明進(jìn)行操作，收集各組Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)上清液，使用OD值作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。根據(jù)Tca8113細(xì)胞上清OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中可以查出對應(yīng)濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間的比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組載體酶切鑒定

質(zhì)粒Psilence 2.1-U6-neo基因序列里沒有SalⅠ酶切位點，本研究插入的序列里設(shè)計有SalⅠ酶切位點，Pu-VEGF-siRNA和Pu-HK質(zhì)粒均能被SalⅠ酶切，即均為插入正確的質(zhì)粒（圖 1）。

2.2 重組載體基因測序

經(jīng)酶切鑒定的重組質(zhì)粒送往上海生工公司進(jìn)行DNA全長測序。所得結(jié)果如圖2～3。經(jīng)Blaster對比，測序結(jié)果與GenBank的VEGF基因序列完全一致，證實重組載體構(gòu)建成功。

2.3 免疫組織化學(xué)染色SABC法分析Tca8113細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白表達(dá)

圖1 重組載體的酶切鑒定

圖2 Pu-VEGF-siRNA DNA測序

圖3 Pu-HK DNA測序

圖4 空白對照組Tca8113細(xì)胞胞漿染色明顯（×400）

結(jié)果如圖4～6所示，實驗組細(xì)胞與實驗對照組及空白對照組比較，細(xì)胞著色顆粒明顯減少，而且著色變淺。對照組灰度值比實驗組的明顯降低（P＜0.05）。實驗對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定Tca8113細(xì)胞上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白表達(dá)

實驗組細(xì)胞與實驗對照組及空白對照組比較，VEGF蛋白濃度有所降低（P＜0.05）。以實驗對照組VEGF相對水平作參照，實驗組濃度下降34.64%。與空白對照組比較，蛋白質(zhì)量濃度相似，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖7。

3 討論

圖5 實驗對照組Tca8113細(xì)胞胞漿染色明顯（×400）

圖6 實驗組TCA8113細(xì)胞胞漿染色減少（×400）

RNAi（RNA interference）是指由小分子雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈RNA時，相應(yīng)mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，它具有高穩(wěn)定性、靶向性和高效率性等特點[4]，目前已經(jīng)成為篩選新基因、基因功能研究、基因疾病治療和尋找藥物靶點的重要工具[5-7]。

本實驗以人VEGF基因作為RNAi的靶基因，目的通過VEGF siRNA靶向阻斷或抑制VEGF的表達(dá)，達(dá)到阻斷或抑制VEGF促舌癌血管形成，進(jìn)而抑制舌癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的目的。VEGF mRNA的剪切方式的不同可產(chǎn)生5種不同形式蛋白分子：VEGF206、VEGF189、VEGF165、VEGF145、VEGF121。不同的VEGF分子協(xié)同作用促進(jìn)腫瘤血管形成[8]。本實驗利用基因重組技術(shù)，根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫已知VEGF mRNA序列，參考siRNA的設(shè)計有關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計針對VEGF mRNA公共序列的靶點，體外構(gòu)建Pu-VEGF-siRNA重組載體，然后利用轉(zhuǎn)染技術(shù)將其轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞并使其在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。常規(guī)SABC法和ELISA檢測Tca8113細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)結(jié)果表明：轉(zhuǎn)染Pu-VEGF-siRNA重組載體后，實驗組Tca8113細(xì)胞的VEGF蛋白表達(dá)較空白對照組和實驗對照組有所減弱，而且空白對照組和實驗對照組的VEGF蛋白表達(dá)無明顯差異；說明所構(gòu)建的真核表達(dá)載體Pu-VEGF-siRNA對人舌癌細(xì)胞株Tca8113中VEGF有較強(qiáng)的特異性抑制效果。這與其他學(xué)者[8]構(gòu)建針對VEGFmRNA公共序列靶點，體外構(gòu)建重組載體，轉(zhuǎn)染相應(yīng)癌細(xì)胞后有效抑制VEGF表達(dá)結(jié)果一致。

圖7 三組細(xì)胞上清液血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子蛋白濃度

筆者通過構(gòu)建Pu-VEGF-siRNA重組載體并體外轉(zhuǎn)染舌癌Tca8113細(xì)胞，實驗結(jié)果表明能夠特異和有效地抑制癌細(xì)胞VEGF的表達(dá)。這為應(yīng)用RNA干擾技術(shù)對舌癌進(jìn)行基因治療提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)，為舌癌的治療選擇開辟了新的途徑。

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