趙琳蕾，王 婷，馮超蕙，付開霞，郭秋梅

(甘肅省康復(fù)中心醫(yī)院，蘭州 730000)

腫瘤作為機體的非我成分，免疫系統(tǒng)能產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細胞增生和轉(zhuǎn)移。大量研究提示惡性腫瘤患者的免疫系統(tǒng)在腫瘤局部和全身都處于耐受或缺陷狀態(tài)，腫瘤在逃逸機體的免疫機制之后才得以進展。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)及基因生物工程技術(shù)的發(fā)展，以腫瘤免疫治療為代表的腫瘤生物治療已成為繼手術(shù)、化療、放療治療腫瘤的新模式。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)參與了腫瘤免疫耐受機制，這類細胞具有

免疫抑制及免疫無能等特性。隨著腫瘤的免疫治療成為腫瘤治療的重要手段之一，Treg細胞在腫瘤治療方面的應(yīng)用也成為研究的熱點?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，本實驗將探討CD4+CD25+Treg細胞在子宮內(nèi)膜癌局部和全身免疫中的作用機制，旨在為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)防及生物治療方面提供新的切入點。

1 資料與方法

1.1 資料 選擇2009年1月至2012年6月就診于我科的子宮內(nèi)膜癌患者26例，年齡28～75歲，平均(51.09±6.88)歲。所有病例均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，未行抗腫瘤治療，且3個月內(nèi)未使用過免疫增強或抑制劑。手術(shù)病理分期、組織分類均參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2000年標準進行。子宮內(nèi)膜樣腺癌10例，腺鱗癌8例，透明細胞癌3例，鱗癌5例。FIGO分期:Ⅰ期+Ⅱ期10例，Ⅲ期+IV期16例。另選擇經(jīng)年齡相匹配的25位健康志愿者作為正常對照組，年齡30 ～81歲，平均(54.25±9.20)歲。

1.2 方法

1.2.1 標本處理

1.2.1.1 外周血單個核細胞(PBMCs)制備 采集研究對象術(shù)前、健康志愿者同一時間外周靜脈血2 ml，EDTA抗凝;15 ml離心管內(nèi)加入適量淋巴細胞分離液，將EDTA抗凝血用PBS等倍稀釋后，輕緩鋪在分離液面上;離心1200 rpm×10min;吸取界面細胞，冰PBS洗滌2次后重懸細胞備用。

1.2.1.2 腫瘤浸潤性淋巴細胞(TILs)和非腫瘤浸潤性淋巴細胞(NILs)制備 取手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織、洗凈，在無菌條件下去除壞死組織及結(jié)締組織，剔除脂肪組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊;在碎組織塊中加入終濃度0.1%的膠原酶，置4℃條件下消化24 h，細胞懸液經(jīng)100目鋼絲或尼龍網(wǎng)過濾，過濾后的細胞懸液以50 rpm離心10 min，棄上清，加適量Hanks液稀釋，在試管中依次加入100%、75%Ficoll-Hypaque分離液及細胞懸液，進行不連續(xù)密度梯度，2000 rpm離心10 min，收集75%與100%之間界面上的細胞懸液備用。取距離腫瘤5 cm的組織作為對照，制備非腫瘤浸潤性淋巴細胞，方法同上。

1.2.2 流式細胞儀檢測 將PBMCs/TILs/NILs加樣至流式檢測管內(nèi)，每管至少2×105個細胞，加入CD4-PE、CD25-FITC單抗和 CCR4-PE，4℃孵育 20 min，加入PBS 2 ml洗滌，并以200×g離心沉淀5 min，吸去上清，混勻細胞后加入0.5 ml l%多聚甲醛，上流式細胞儀(美國Beckman-Coulter公司產(chǎn)品)檢測或置2～8℃冰箱中備用。

1.2.3 ELISA法測定IL-10和TGF-β水平 取100 μl標準品，各組血清加入相應(yīng)試劑板的微孔中，再加入生物素化抗體工作液100 μl/孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，室溫共同孵育120 min，自動洗板機洗滌4次，加入酶結(jié)合物工作液100 μl/孔，封住板孔，室溫孵育30 min，洗板4次。每孔中加入底物各50 μl，避光 37℃30 min，見顯色后加終止液 50 μl。用美國ELX800全自動定量繪圖酶標儀在450 nm處測定OD值，計算樣品含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，非正態(tài)分布資料采用Kruskal-Wallis H檢驗;兩組比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+Treg檢測結(jié)果 腫瘤組織CD4+CD25+Treg占 CD4+T細胞比例為(23.91±3.72)%，明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。子宮內(nèi)膜癌患者外周血Treg水平高于癌旁組織及對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。癌旁組織和對照組的Treg水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。腫瘤組織 CCR4陽性細胞占CD4+T細胞比例為(96.37±11.46)%，明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。子宮內(nèi)膜癌患者外周血CCR4陽性細胞高于癌旁組織及對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。癌旁組織和對照組的CCR4陽性細胞水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 CD4+CD25+Treg及CCR4表達水平檢測結(jié)果()

表1 CD4+CD25+Treg及CCR4表達水平檢測結(jié)果()

注:與對照組、腫瘤患者外周血、癌旁組織相比較，*P＜0.05

2.2 CD4+CD25+Treg與子宮內(nèi)膜癌臨床及病理特征間的關(guān)系 選擇子宮內(nèi)膜癌患者外周血單個核細胞和腫瘤浸潤性淋巴細胞中CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的百分比，結(jié)合臨床及病理特征參數(shù)作分層分析。結(jié)果顯示:FIGO分期I-II期患者的外周血單核細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞中，CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的百分比分別為(6.35±0.92)%和(18.33±2.06)%，均顯著低于 III-IV 期患者的(12.16 ±2.61)%和(28.93 ±3.51)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組外周血單核細胞、腫瘤浸潤性淋巴細胞中，CD4+CD25+Treg占CD4+T細胞的百分比分別為(12.73±2.04)%和(32.99 ±1.47)%，均顯著高于無轉(zhuǎn)移組的(5.77±1.72)%和(14.06 ±3.92)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);在年齡、病理類型、組織學(xué)分級等之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 CD4+CD25+Treg與子宮內(nèi)膜癌臨床及病理特征間的關(guān)系(n=26，)

表2 CD4+CD25+Treg與子宮內(nèi)膜癌臨床及病理特征間的關(guān)系(n=26，)

2.3 子宮內(nèi)膜癌患者血清IL-10和TGF-β水平檢測 子宮內(nèi)膜癌患者的IL-10和TGF-β水平分別為(128.93 ±10.52)pg/ml和(69.35 ±7.36)ng/L，顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表3。

表3 兩組血清IL-10和TGF-β水平檢測結(jié)果(n=26，)

表3 兩組血清IL-10和TGF-β水平檢測結(jié)果(n=26，)

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)有關(guān)，機體的細胞免疫功能受到抑制是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要原因。Treg細胞在腫瘤細胞逃逸機體的免疫過程中通過抑制激活的T細胞功能而在維持自身免疫耐受性中發(fā)揮著重要作用［1］。子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma，EC)是婦科生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤20% ～30%，發(fā)病率近年呈上升趨勢，全球每年約有超過10萬余名婦女患子宮內(nèi)膜癌，并有4萬患者死于該疾病［1］，Ⅳ期患者 5 年生存率僅為 5% ～ 23%［2］。因此子宮內(nèi)膜癌是目前嚴重威脅著女性健康的惡性腫瘤之一。對子宮內(nèi)膜癌的治療提倡精確的手術(shù)分期，以手術(shù)為主、放療、化療為輔的綜合治療。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)及基因生物工程技術(shù)的發(fā)展，以腫瘤免疫治療為代表的腫瘤生物治療已成為繼手術(shù)、化療、放療治療腫瘤的新模式。

近幾年，越來越多的證據(jù)表明［3］，在腫瘤形成過程中除了細胞的癌基因和抑癌基因活化和失活，機體免疫監(jiān)視系統(tǒng)的逃逸也是不容忽視的重要因素，腫瘤細胞可以通過某些途徑逃逸或者抑制機體免疫反應(yīng)而確保其自身的發(fā)生發(fā)展。調(diào)節(jié)性T細胞是一群具有免疫抑制功能的負調(diào)控細胞，具有:①免疫無能性:表現(xiàn)在對高濃度白細胞介素-2的單獨刺激，固相包被或可溶性抗 CD3單抗，以及抗CD3單抗、抗CD28單抗的聯(lián)合作用呈無應(yīng)答狀態(tài)，也不分泌IL-2。當經(jīng)T細胞受體(TCR)介導(dǎo)信號刺激并有高濃度外源 IL-2存在的情況下，CD4+CD25+Treg可活化并增殖，但其增殖程度較CD4+CD25-T細胞弱得多。② 免疫抑制性:表現(xiàn)在經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激活化以后能夠抑制CD4+和CD8+T細胞的活化和增殖。經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號刺激可以是用抗CD3單抗產(chǎn)生的多克隆的刺激，也可以是抗原特異性刺激，一旦CD4+CD25+Treg細胞被活化，其抑制效應(yīng)呈現(xiàn)為非抗原特異性，即對CD4+和CD8+T細胞均有抑制作用［4］。這一現(xiàn)象可以通過Treg的細胞因子作用模式得以印證:Treg合成分泌抑制性細胞因子反應(yīng)系非特異性的，故活化Treg對效應(yīng)性T細胞的作用也是抗原非特異性的。CD4+CD25+Treg能抑制T細胞對外源和自體抗原的免疫反應(yīng)，因此在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止了機體對自體同源腫瘤細胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg細胞影響著免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的應(yīng)答，從而影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。已有研究證實［5］，Treg細胞與許多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后均有密切關(guān)系。其中，CD4+CD25+Treg細胞發(fā)揮抑制抗腫瘤免疫作用主要發(fā)生在兩個部位:一是在腫瘤細胞引流淋巴結(jié)內(nèi)，這些大量增殖的CD4+CD25+Treg細胞抑制了同一淋巴結(jié)中效應(yīng)T細胞的增殖;二是在腫瘤組織內(nèi)，增加的CD4+CD25+Treg細胞抑制腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor-infiltrating lymphocyte，TIL)中效應(yīng)T細胞殺傷腫瘤細胞的功能。隨著腫瘤的免疫治療成為腫瘤治療的重要手段之一，Treg細胞在腫瘤治療方面的應(yīng)用也成為研究的熱點。

1995年，Sakaguchi研究小組首先報道和定義了具有免疫抑制功能的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞亞群。此后，從人體外周血中也分離鑒定出表型和功能類似的T細胞亞群，它是一種免疫抑制性細胞，能夠分泌白細胞介素4(IL-4)、IL-10和轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β等，正常人外周血中，CD4+CD25+Treg較少，占總CD4+T細胞的5% ～10%，具有免疫無能性和免疫抑制性兩大特征，被稱為＂職業(yè)/專職性抑制細胞＂。進一步研究發(fā)現(xiàn)，除起源于胸腺的自然發(fā)生調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+naturally occurring regulatory T cells，nTregs)外，還存在外周發(fā)生的獲得或誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細胞(adaptive or induced regulatory Tcells，aTregs or iTregs)，但兩者從表型特征和功能特性難以區(qū)分。此后人們對CD4+CD25+Treg細胞的研究予以了極大的關(guān)注。Treg分子作用機制逐漸被闡明，其調(diào)節(jié)功能在機體免疫穩(wěn)態(tài)維持、移植耐受、過敏反應(yīng)、微生物感染及腫瘤免疫等方面均得到了證實。CD4+CD25+Treg能抑制T細胞對外源和自體抗原的免疫反應(yīng)，因此在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止了機體對自體同源腫瘤細胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg細胞影響著免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的應(yīng)答，從而影響著腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Mao等［6］研究發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤患者中CD4+CD25+FOXP3+Treg含量明顯增加，Patel等研究發(fā)現(xiàn)，CD4+的T細胞在宮頸上皮內(nèi)瘤樣變中發(fā)揮主導(dǎo)作用，CD8+的T細胞在宮頸癌中起主要作用，CD4+CD25+的Treg在宮頸癌中明顯增加，Barnett等［7］的研究證實，卵巢癌患者Treg細胞數(shù)量的增加與卵巢癌的進展程度呈正相關(guān)。Graziano等［8］報道胃癌患者腫瘤內(nèi)FOXP3+Tregs水平的升高通常提示預(yù)后較差，5年生存率低，手術(shù)根治切除后Tregs明顯下降，但手術(shù)后再次復(fù)發(fā)者Tregs數(shù)量也會隨之升高。Kobayashai等［9］對323例癌的病變、早晚期肝癌，39例肝內(nèi)膽管癌和39例轉(zhuǎn)移性肝癌結(jié)節(jié)進行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)肝癌組織中Tregs數(shù)量明顯高于正常肝組織，Tregs在原發(fā)肝癌組織中的數(shù)量明顯高于轉(zhuǎn)移性肝癌結(jié)節(jié)中的數(shù)量，并且提出肝癌組織中浸潤性Tregs密度是肝癌的獨立性預(yù)后因素。Generali等［10］報道Tregs與乳腺癌患者預(yù)后問的關(guān)系，顯示Tregs在導(dǎo)管原位癌和浸潤性乳腺癌中的量高于正常乳腺組織，在浸潤性乳腺癌中又高于導(dǎo)管原位癌，而Tregs水平增高與導(dǎo)管原位癌患者的高復(fù)發(fā)風險和浸潤癌患者之疾病進展生存期和總生存率縮短均有關(guān)。上述研究結(jié)果證實Tregs在腫瘤中的水平增高是一種普遍存在的現(xiàn)象，也意味著Tregs與腫瘤生長和患者預(yù)后有密切關(guān)系。目前認為，這可能與Tregs參與腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)，機制如下:① 細胞毒作用:穿孔素-顆粒酶通路一直被認為是CD8+T細胞和NK細胞殺傷變異的宿主細胞的途徑，其機制是細胞毒性淋巴細胞通過穿孔素將顆粒酶A和B輸送入靶細胞，使其作用于細胞內(nèi)重要底物，從而誘導(dǎo)靶細胞的凋亡。但是近年來研究卻發(fā)現(xiàn)Tregs也能通過穿孔素-顆粒酶介導(dǎo)的細胞毒作用途徑發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)。Grossman等［11］最先發(fā)現(xiàn)使用抗CD3和CD46單克隆抗體激活的人Tregs細胞能夠表達顆粒酶A和(或)B，并且能殺傷自身免疫性細胞，這一由Tregs介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)是穿孔素依賴性的而非FasL依賴性途徑。與此相同，Gondek等［12］報道抗CD3單克隆抗體刺激產(chǎn)生的鼠源性Tregs能夠表達顆粒酶B，并且通過細胞接觸性的顆粒酶B依賴性機制，發(fā)揮抑制CD4+CD25+T細胞增殖的作用。另外，Cao等［13］在體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)，存在于腫瘤微環(huán)境中的細胞因子可以誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)的Tregs高表達顆粒酶B，而顆粒酶B缺乏小鼠對移植瘤的排斥作用增強，通過對腫瘤微環(huán)境中所有淋巴細胞亞型進行分析發(fā)現(xiàn)Tregs可利用顆粒酶B抑制NK細胞和CD8+T細胞活性，并且這種抑制作用是依賴于穿孔素的作用完成的;②分泌抑制性細胞因子:IL-10、TGF-β免疫抑制作用已在多種免疫疾病模型中得到證實。Loser等［14］發(fā)現(xiàn)在射線誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌形成過程中，IL-10在CD25+CD4+Tregs介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)抑制方面具有重要作用。Chen等［15］則通過建立抗原特異性小鼠結(jié)腸癌模型，發(fā)現(xiàn)CD25+CD4+Tregs可以通過特異性的抑制CD8+細胞的細胞毒作用，抑制CD8+T細胞介導(dǎo)的腫瘤清除效應(yīng)，而在這一抑制作用過程中，TGF-β發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因為 TGF-β受體陰性表達的CD8+T細胞能夠?qū)regs介導(dǎo)的免疫抑制產(chǎn)生明顯耐受，并且這些CD8+T細胞仍能發(fā)揮其細胞毒作用。另外，Ghiringhelli等［16］觀察發(fā)現(xiàn)，在胃腸道間質(zhì)瘤患者中，自然殺傷(natural killer，NK)細胞活性與Tregs擴增水平呈負相關(guān)。進一步的研究則表明，人體Tregs是通過膜結(jié)合性TGF-β直接抑制NK細胞效應(yīng)因子功能并且下調(diào)NK細胞表面的NKG2D受體，從而抑制NK細胞活性。以上研究結(jié)果均顯示，Tregs細胞可以通過分泌 TGF-β抑制CD8+T細胞及NK細胞的抗腫瘤效應(yīng)。近來也有研究表明，由頭頸鱗癌患者體內(nèi)分離出來的Tregs能夠通過IL-10和TGF-β依賴性機制抑制機體的抗腫瘤效應(yīng)，更進一步證明了Tregs可通過分泌IL-10、TGF-β等免疫抑制性細胞因子發(fā)揮免疫抑制作用;③通過與效應(yīng)T細胞競爭結(jié)合IL-2或直接作用，抑制其增殖并誘導(dǎo)其免疫無能;④ 誘導(dǎo)APC向免疫耐受方向發(fā)展;⑤抑制免疫效應(yīng)細胞向腫瘤局部微環(huán)境聚集。

腫瘤微環(huán)境在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用已被證實，本研究結(jié)果提示，Treg細胞在腫瘤局部的水平明顯高于外周血，此種腫瘤微環(huán)境中的調(diào)節(jié)性T細胞被證實包含胸腺來源的自然發(fā)生調(diào)節(jié)性T細胞和局部誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性T細胞，可能系通過募集機制富集于腫瘤局部。Curiel等［17］證實，腫瘤細胞和微環(huán)境內(nèi)巨噬細胞分泌 CCL22，趨化表達 CCR4的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞優(yōu)先向腹水和瘤體內(nèi)聚集，首次揭示人體調(diào)節(jié)性T細胞可通過趨化因子-趨化因子受體軸向腫瘤內(nèi)特異性募集和積聚。本課題檢測CCR4+細胞表達水平后發(fā)現(xiàn)，其在子宮內(nèi)膜癌患者腫瘤組織的表達明顯高于外周血，這與Treg細胞水平表達一致，提示，CCL22-CCR4軸在Treg細胞向瘤體內(nèi)募集中發(fā)揮著重要作用。

Treg細胞對效應(yīng)性T細胞的抑制作用可以通過細胞接觸機制和細胞因子分泌方式實現(xiàn)。研究表明［18］，IL-10及 TGF-β 在 Treg細胞的免疫抑制效應(yīng)中起主要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)，Treg在體內(nèi)可并不影響自身反應(yīng)性細胞的增殖，而是將病理性自身免疫性Th1細胞轉(zhuǎn)化成了分泌高水平IL-10的T細胞，這些細胞可以以IL-10依賴的方式抑制實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓膜炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)的發(fā)作。IL-10不僅在以上提及的Th1細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病中起到重要的免疫調(diào)控作用，也在抑制Th2細胞介導(dǎo)的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)等疾病中發(fā)揮了重要作用。事實上，當前變應(yīng)原特異性免疫治療(amplified immune therapy，AIT)的關(guān)鍵目標之一就在于誘導(dǎo)出分泌IL-10的Treg。IL-10可通過抑制樹突狀細胞(dendritic cell，DC)和巨噬細胞產(chǎn)生炎性細胞因子，以及抑制MHCⅡ和共刺激因子的表達等機制來抑制Th1效應(yīng);通過抑制Th2細胞因子的產(chǎn)生、IgE的合成、肥大細胞和嗜酸性粒細胞的生存與活化等機制來抑制Th2效應(yīng)。另外，IL-10還可抑制巨噬細胞殺滅胞內(nèi)病原體及抑制單核細胞前體發(fā)育為DC。TGF-β的作用機制與IL-10大致相似，主要包括抑制B細胞、Th細胞及CTL的增殖、分化與功能等。另外，TGF-β亦可能在將CD4+CD25-T細胞誘導(dǎo)成CD4+CD25+Treg的過程中起到重要作用。近來有研究發(fā)現(xiàn)，除了在胸腺外，CD4+CD25+Treg也可由外周循環(huán)中的CD4+CD25-T細胞經(jīng) TGF-β誘導(dǎo)而成，且這種TGF-β誘導(dǎo)形成的Treg(Ti-Treg)能顯著抑制Th1細胞介導(dǎo)的結(jié)腸炎。本研究證實，子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)IL-10、TGF-β水平明顯高于對照組，提示Treg通過分泌IL-10和TGF-β等抑制性細胞因子及細胞接觸依賴的抑制途徑，抑制免疫效應(yīng)細胞，進一步促進腫瘤細胞的免疫逃逸。

總之，子宮內(nèi)膜癌患者體內(nèi)CD4+CD25+Treg細胞明顯上調(diào)，且在腫瘤組織局部表現(xiàn)更為明顯，這可能參與了腫瘤的免疫逃逸，促進腫瘤生長和演進，機制可能與IL-10、TGF-β及CCR4表達上調(diào)有關(guān)。但本研究仍存在樣本量小的局限性，尚需開展更大樣本、多中心研究來證實本研究結(jié)果。

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