李建成，彭世清，胡章立

1)海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，?？?70228;2)深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳市海洋生物資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，深圳518060;3)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海口571101

超抗原 (superantigen)是一類可與抗原呈遞細(xì)胞 (antigen presenting cell，APC)上主要組織相容性復(fù)合物II(major histocompatibility complex class II，MHCII)和 T淋巴細(xì)胞受體 (T cell receptor，TCR)的Vβ區(qū)結(jié)合而刺激T細(xì)胞活化增殖的抗原［1］.金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus，S.aureus)腸毒素 C2(staphylococcal enterotoxin C2，SEC2)是一種外源性超抗原，僅需微量 (ng級)就能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，刺激非特異性T細(xì)胞大量增殖，提高機(jī)體免疫能力［2］.然而，微量的SEC2即可引起人體及動物多種組織和器官的損傷［3-4］，嚴(yán)重制約了SEC2在抗腫瘤生物制劑和動物免疫增強(qiáng)劑等方面的應(yīng)用.Wright A等［5］發(fā)現(xiàn)，SEC2基因的第118位組氨酸 (Histidine，His)是重要的毒素位點(diǎn)，與其催吐機(jī)制密切相關(guān).為獲得既具有超抗原特性，又不會嚴(yán)重?fù)p傷機(jī)體組織器官的減毒腸毒素C2，本研究通過對sec2基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得具有超抗原性的sec2t基因.

萊茵衣藻是一種單細(xì)胞真核綠藻，生長迅速，光合效率高，且遺傳背景清晰，是目前少數(shù)3套基因組 (細(xì)胞核、葉綠體和線粒體)都能進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的生物［6］.由于萊茵衣藻蛋白質(zhì)和糖類等營養(yǎng)物質(zhì)含量高且不產(chǎn)生內(nèi)毒素，作為可食性疫苗生物載體具有重要意義.本研究將sec2t基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻，并分析轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的免疫學(xué)特性，為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因藻生產(chǎn)抗腫瘤制劑和動物免疫增強(qiáng)劑奠定基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 材料和試劑

大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)Top10、質(zhì)粒pH124(含ble基因，可使宿主細(xì)胞具有腐草霉素和Zeomycin抗性)，野生型萊茵衣藻均由本實(shí)驗(yàn)室保存.克隆載體PMD18-T simple購自寶生物工程(大連)有限公司.分泌SEC2的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株由深圳市疾病預(yù)防控制中心惠贈.Balb/c小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心.測序工作由北京六合華大基因科技股份有限公司完成.限制性內(nèi)切酶HindⅢ、NheⅠ、PmacⅠ 和 T4連接酶均購自 MBI Fermentas.點(diǎn)突變試劑盒 (Mutaan BEST kit)和DNA聚合酶LA Taq均購自寶生物工程 (大連)有限公司.

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Genbank已知的金黃色葡萄球菌SEC2基因登錄號 (Genbank登錄號AY450554)分別設(shè)計(jì)點(diǎn)突變及克隆所需特異性引物:P1:5'-AAGTTATGTATGTAGATAAATTTTTGGCACATG-3'，P2:5'-TAGTTGCTGATACATAATGATCATCATATAAAT-3';C1:5'-CATGCTAGCGAGAGTCAACCACCAGACCCTACGCCAG-3'，C2:5'-CGCACGTGTTATCCATTCTTTGTTGTAAGGTGG-3'.

1.3 克隆金黃色葡萄球菌sec2基因

利用試劑盒(Takara mini BEST bacterial genomic DNA extraction kit ver.2.0)提取金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株總DNA，以C1和C2為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(反應(yīng)體系為:反應(yīng)酶 LA Taq 0.5 μL、10×LA PCR 緩沖液5 μL、dNTP Mixture 8 μL、模板基因組DNA 1 μL、引物C1和 C2各0.5 μL，補(bǔ)水至總體積50 μL).PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃反應(yīng)30 s，55℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)1min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min.PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 (瓊脂糖質(zhì)量濃度為10 g/L)，并將電泳片段利用膠回收試劑盒(Takara agarose gel DNApurification kit ver.2.0)切膠回收.回收產(chǎn)物與T載體在16℃水浴條件下連接過夜，然后轉(zhuǎn)入E.coli Top10中，再將轉(zhuǎn)化菌液涂抹在有氨芐抗性的LB平板上，培養(yǎng)12～16 h后，將生長良好的單克隆接種于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜.采用十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)堿裂解法提取質(zhì)粒，并對質(zhì)粒進(jìn)行PCR和酶切鑒定.

1.4 金黃色葡萄球菌SEC基因的定點(diǎn)突變

以sec2基因?yàn)槟０?，P1和P2為引物，采用點(diǎn)突變試劑盒 (Mutaan BEST kit)進(jìn)行PCR擴(kuò)增.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)平末端處理后，連接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E.coli Top10中，挑取陽性克隆進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)送北京六合華大基因科技股份有限公司測序.

1.5 構(gòu)建含sec2t基因的萊茵衣藻表達(dá)載體

將突變成功且已連接到T載體上的sec2t基因和pH124載體同時(shí)用NheⅠ和PmacⅠ酶切，然后進(jìn)行切膠回收，得sec2t基因片段和線性化的pH124載體，將兩者的回收產(chǎn)物用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn)入E.coli Top10中，挑取陽性克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定.

1.6 萊茵衣藻的遺傳轉(zhuǎn)化

采用“珠磨法”進(jìn)行萊茵衣藻遺傳轉(zhuǎn)化.具體方法如下:①將細(xì)胞壁缺陷性萊茵衣藻CC-849接種于新鮮TAP培養(yǎng)基中，連續(xù)光照條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期 (細(xì)胞濃度為1×106～2×106/mL);室溫條件下5 000 r/min離心6 min，棄上清，收集藻細(xì)胞;②用新鮮無菌的TAP培養(yǎng)液重懸沉淀，調(diào)整藻細(xì)胞濃度至2×108/mL.取懸浮液300 μL于1.5 mL的EP管中 (含滅菌的玻璃珠);③將目的DNA酶切成線狀，加入EP管中，快速振蕩25 s，使玻璃珠、藻株和外源DNA充分混勻;④將混合液轉(zhuǎn)移到50 mL已滅菌的培養(yǎng)管中，加入10 mL無菌新鮮TAP培養(yǎng)液，100 r/min搖床培養(yǎng)過夜，使細(xì)胞恢復(fù);⑤室溫離心，去上清，收集藻液，用0.8 mL TAP培養(yǎng)液輕輕重懸，加入3.5 mL TAP培養(yǎng)基(瓊脂糖質(zhì)量濃度為5 g/L)，均勻涂布在TAP平板上 (含Zeomycin抗生素)，靜置30 min后，轉(zhuǎn)移至22°C光照培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～4周，平板上長出的綠色單克隆即為轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻.

1.7 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的分子檢測

1.7.1 PCR和RT-PCR分析

將獲得的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻接種于新鮮TAP培養(yǎng)基中，光照培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用Takara universal genomic DNA extraction kit ver.3.0提取總DNA，以提取的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增;采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (Takara prime scrip RT reagent kit with gDNA eraser)對轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻總RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增.PCR和RT-PCR引物均為C1和C2.PCR反應(yīng)體系為:Premix Ex Taq 10 μL、引物C1和C2各0.5 μL、模板 1 μL，補(bǔ)水至總體積 20 μL.PCR 反應(yīng)條件為:97℃預(yù)變性5 min;94℃反應(yīng)30 s，60℃反應(yīng)30 s，72℃反應(yīng)1 min，30個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min.反應(yīng)后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖質(zhì)量濃度為10 g/L)檢測.

1.7.2 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Southern blot分析

步驟如下:①提取轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻總DNA，取10 μg至1.5 mL的EP管中，并加入適量的限制性內(nèi)切酶HindⅢ，37℃酶切過夜;②用Takara DNA fragment purification kit ver.2.0回收DNA片段;③用瓊脂糖凝膠電泳 (瓊脂糖質(zhì)量濃度為8 g/L)分離后，將DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，后與sec2基因探針雜交檢測，探針是用DIG high prime DNA labeling and detection starter kitⅠ標(biāo)記后的set2基因(720 bp).

1.7.3 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Western blot分析

以SEC2單克隆抗體為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行免疫印跡，檢測轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻SEC2蛋白質(zhì)的表達(dá).具體方法如下:①提取轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻總蛋白，取10 μg進(jìn)行SDSPAGE電泳;②將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到NC膜上，4℃條件下，置于20 mL封閉液 (由BSA和TBST混合液組成，BSA體積分?jǐn)?shù)為3%)中過夜;③取出NC膜，按1∶1 000用封閉液稀釋一抗，37℃雜交箱中雜交1 h;④用TBST洗膜3次，每次10 min，然后按1∶1 000用TBST稀釋二抗，雜交2 h;⑤用TBST洗膜3次，每次10 min;⑥將膜置于暗處，加入適量的堿性磷酸酶底物 (BCIP和NBT)顯色.

1.8 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的免疫活性檢測

1.8.1 小鼠脾臟細(xì)胞制備

取6周齡清潔級雄性Balb/c小鼠，分3組，每組8只，分別喂食轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻、野生型萊茵衣藻CC-849和無菌生理鹽水，連續(xù)喂養(yǎng)1個(gè)月，期間每隔1 d用針頭灌胃器罐注上述相應(yīng)液體2 mL.喂養(yǎng)成熟后斷頸處死小鼠，浸泡于體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中.無菌條件下取出小鼠脾臟，用無菌注射器柄碾碎，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)過濾后，將分離液迅速轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中，覆蓋500 μL的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基 (保持液面分界明顯)，在室溫下以2 400 r/min離心30 min(設(shè)置較慢的加速和減速程序);吸出淋巴細(xì)胞層，再加入10 mL RPMI-1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌;在室溫下以1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞.

1.8.2 CD4和CD8T淋巴細(xì)胞亞群的測定

取制備好的小鼠脾臟細(xì)胞，分別加入抗小鼠FITC-CD3e、FITC-CD8a和 FITC-CD4單克隆抗體，室溫條件下暗室孵育10 min，用PBS緩沖液洗去多余抗體，再用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞熒光，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 超抗原SEC2基因的克隆與定點(diǎn)突變

以分泌SEC2的金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株總基因組DNA為模板，C1和C2為引物進(jìn)行PCR，所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 (瓊脂糖質(zhì)量濃度為10 g/L)分析，結(jié)果如圖1.由圖1可見，在720 bp處有疑似目的基因條帶.序列分析證實(shí)，該片段為超抗原sec2基因片段，與Genbank已知的金黃色葡萄球菌sec2基因 (Genbank登錄號AY450554)序列一致.

圖1 金黃色葡萄球菌sec2基因PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products of enterotoxin C2 gene in Staphylococcal aureus

以連接在T載體上的sec2基因?yàn)槟０?，P1和P2為引物進(jìn)行PCR介導(dǎo)的sec2基因點(diǎn)突變.經(jīng)六合華大基因科技股份有限公司測序，證明超抗原sec2基因第118位組氨酸密碼子已突變?yōu)槔野彼崦艽a子.

2.2 萊茵衣藻表達(dá)載體pH124sec2t的構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化

將sec2t基因插入含Hsp70A-RBCS2啟動子和RBCS2終止子的pH124載體，通過酶切鑒定和序列分析，證明萊茵衣藻表達(dá)載體pH124sec2t構(gòu)建成功.通過“珠磨法”將表達(dá)載體pH124sec2t轉(zhuǎn)入細(xì)胞壁缺陷型萊茵衣藻 CC-849中，在含10 μg/mL Zeomycin的TAP平板上培養(yǎng)3～4周后，獲得大量的陽性轉(zhuǎn)化子.對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR和RT-PCR分析，均獲得720 bp的片段，見圖2，初步驗(yàn)證篩選到轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t.

圖2 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的PCR和RT-PCR分析結(jié)果Fig.2 PCR and RT-PCR results of Tran-sec2t in Chlamydomonas reinhardtii

2.3 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻的Southern blot分析

提取轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t總DNA，用內(nèi)切酶HindⅢ酶切過夜，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳 (瓊脂糖質(zhì)量濃度為8 g/L)分離后，轉(zhuǎn)移至帶正電荷的陽性尼龍膜，使用地高辛標(biāo)記的SEC2探針進(jìn)行雜交，結(jié)果如圖3.由圖2可見，在1 515～1 482 bp、6106～4 899 bp間均有一條帶，而陰性對照萊茵衣藻CC-849中無相應(yīng)條帶出現(xiàn)，說明sec2t基因已成功整合到萊茵衣藻中，且在轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t中有兩個(gè)拷貝.

圖3 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的Southern blot分析結(jié)果Fig.3 Southern blot results of Tran-sec2t in Chlamydomonas reinhardtii

2.4 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的Western blot分析

提取轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t和野生型萊茵衣藻CC-849的總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳(丙烯酰胺質(zhì)量濃度為120 g/L)，上樣量10 μg，然后轉(zhuǎn)移至NC膜上，以SEC2單克隆抗體為一抗、堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗小鼠IgG為二抗進(jìn)行免疫雜交反應(yīng).轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻與陽性對照所出現(xiàn)的雜交條帶相對分子質(zhì)量大小一致，且陰性對照 (萊茵衣藻CC-849)總蛋白中無相應(yīng)大小的條帶，表明sec2t基因已在轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻中正常表達(dá)，如圖4.

2.5 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的免疫學(xué)活性

利用流式細(xì)胞儀對喂食不同藻細(xì)胞培養(yǎng)液的Balb/c小鼠CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測分析，結(jié)果見表1.由表1可見，喂食轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t小鼠的CD4+與CD8+細(xì)胞數(shù)目比值有所降低，但CD3+和CD8+細(xì)胞明顯增殖.CD4+細(xì)胞數(shù)目下降的原因可能是由于CD8+細(xì)胞的大量增殖抑制了CD4+細(xì)胞的克隆.由此可知，表達(dá)減毒超抗原SEC2的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻能刺激小鼠T淋巴細(xì)胞的大量增殖，從而提高小鼠的機(jī)體免疫應(yīng)答.

圖4 轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的Western blot分析結(jié)果Fig.4 Western blot results of Tran-sec2t in Chlamydomonas reinhardtii

表1 流式細(xì)胞儀測定不同處理組別小鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化情況(±s)Table 1 The variations of T lymphocyte subsets of mouse in different groups(±s)單位:%

表1 流式細(xì)胞儀測定不同處理組別小鼠T淋巴細(xì)胞亞群變化情況(±s)Table 1 The variations of T lymphocyte subsets of mouse in different groups(±s)單位:%

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+與CD8+的比值1.73 ±生理鹽水0.37萊茵衣藻CC-849 32.40 ±5.27 36.59 ±3.29 21.69 ±3.19 2.61 ±0.93轉(zhuǎn)基因藻Tran-sec2t 25.78 ±8.77 38.77 ±2.41 16.019 ±3.83 42.44 ±8.29 33.04 ±2.40 27.28 ±3.70 1.24 ±0.24

3 討論

在可食性藥物和可飼用動物疫苗基因工程表達(dá)體系中，萊茵衣藻表達(dá)體系比哺乳動物細(xì)胞和高等植物系統(tǒng)更具優(yōu)勢:一方面由于萊茵衣藻營養(yǎng)豐富且不產(chǎn)生內(nèi)毒素，自身就是理想的保健食品和動物飼料;另一方面由于其生長速度快且光合效率高，既具有微生物的生長特性又具有高等植物自養(yǎng)優(yōu)勢，生產(chǎn)成本低.Mayfield等［7］用萊茵衣藻葉綠體偏愛密碼子，合成人類抗單純皰疹病毒糖蛋白D抗體大單鏈基因(HAV8-lsc)，并在萊茵衣藻葉綠體表達(dá)，該基因表達(dá)產(chǎn)物的積累量占可溶性蛋白總量的0.5%，且具有抗體活性.Sun等［8］將口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)VP1基因與霍亂毒素B亞基 (cholera toxin B subunit，CTB)基因融合，轉(zhuǎn)入萊茵衣藻葉綠體基因組，使CTBVP1融合蛋白在萊茵衣藻中成功表達(dá)，表達(dá)量占可溶性蛋白總量的3%，該融合蛋白既保留了GM1－神經(jīng)節(jié)苷脂親和力又具有FMDV VP1抗原性，證明了在萊茵衣藻生產(chǎn)黏膜疫苗 (mucosal vaccine)的可行性.本研究將金黃色葡萄球菌sec2t基因轉(zhuǎn)入萊茵衣藻細(xì)胞核基因組，獲得能通過熱激和強(qiáng)光誘導(dǎo)表達(dá)SEC2蛋白的轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻，動物免疫實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻表達(dá)的SEC2蛋白具有超抗原特性，誘導(dǎo)動物CD8+細(xì)胞淋巴細(xì)胞的大量增殖 (表1).盡管萊茵衣藻核表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)外源基因時(shí)的效率較低［9］，但由于 SEC2蛋白是超抗原，只需微量(ng級)就可產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，從而激活非特異性T淋巴細(xì)胞［10］.因此，轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Transec2t在可食性腫瘤治療藥物和可飼性動物疫苗免疫增強(qiáng)劑領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價(jià)值.

SEC2作為細(xì)菌超抗原無需抗原遞呈細(xì)胞加工，直接結(jié)合MHC II分子外側(cè)，激活帶有特異T細(xì)胞受體 (TCR)T淋巴細(xì)胞大量增殖［1］，而T淋巴細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，在自身的炎癥反應(yīng)中起重要作用.本研究發(fā)現(xiàn)，喂食轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻Tran-sec2t的小鼠CD3+細(xì)胞數(shù)量大大增加，說明小鼠機(jī)體免疫應(yīng)答的增強(qiáng);而CD8+細(xì)胞作為參與抗腫瘤作用的主要效應(yīng)細(xì)胞，其數(shù)目的增加表明sec2t具有抑制腫瘤的潛能;另外，轉(zhuǎn)基因萊茵衣藻導(dǎo)致小鼠CD4+與CD8+細(xì)胞數(shù)目比降低 (表1)，說明其對輔助性T淋巴細(xì)胞有損害，原因可能是CD8+細(xì)胞增加抑制了CD4+增殖.有研究表明［11-12］，從小鼠動物模型中分離出來的CD8+T淋巴細(xì)胞具有免疫抑制作用，能特異性地下調(diào)或殺傷經(jīng)MBP活化的CD4+T細(xì)胞的增殖，并能優(yōu)先抑制潛在的病理性自身反應(yīng)性克隆.

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