張松斗，陳麗君，安世恒，杜孟芳

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002)

肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜Ca2+-ATPase(Sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是普遍存在于動(dòng)物肌肉組織中肌質(zhì)網(wǎng)膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶體［1］．Ca2+-ATPase又稱(chēng)鈣泵，是肌質(zhì)網(wǎng)的主要成分，占膜蛋白總量的90%，它與Na+-K+泵和H+-K+泵的相似性較高，均屬于P型ATP酶的蛋白家族．P型ATP酶轉(zhuǎn)運(yùn)離子是一個(gè)主動(dòng)運(yùn)輸?shù)倪^(guò)程，需要水解ATP來(lái)提供能量，且每轉(zhuǎn)運(yùn)2個(gè)Ca2+需要消耗1分子的ATP，因?yàn)樗凶詣?dòng)磷酸化的特征而被稱(chēng)為P型ATP酶［2］．當(dāng)肌細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，在Ca2+-ATP酶的作用下Ca2+由肌質(zhì)網(wǎng)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)它也可以通過(guò)消耗ATP來(lái)實(shí)現(xiàn)鈣離子的逆濃度轉(zhuǎn)運(yùn)，將肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的鈣離子泵入到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)外較高的鈣離子濃度差［3］．因此，Ca2+-ATP酶對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)是很重要的，鈣離子通常與細(xì)胞跨膜信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，鈣離子濃度的變化會(huì)引起相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑的反應(yīng)，導(dǎo)致一系列的生理生化變化．在大部分鱗翅目昆蟲(chóng)中，性信息素是兩性間通訊交流的重要介質(zhì)，是由位于雌蟲(chóng)第8和第9腹節(jié)之間的信息素腺體的上皮細(xì)胞合成，經(jīng)表皮釋放到體外［4］．性信息素多數(shù)為長(zhǎng)鏈的不飽和醇、醋酸酯、醛或酮類(lèi)，在性腺內(nèi)由乙酰輔酶A經(jīng)過(guò)脂肪酸合成、去飽和、碳鏈縮短和羰基碳的還原修飾等作用合成［5］．大部分鱗翅目昆蟲(chóng)性信息素的合成和釋放由性信息素合成激活肽(Pheromone biosynthesis activating neuropeptide，PBAN)來(lái)調(diào)控的．PBAN是一類(lèi)C末端為33或34個(gè)氨基酸殘基的多肽類(lèi)酰胺化合物［6］．其作用機(jī)制被認(rèn)為首先通過(guò)與性信息素腺體細(xì)胞膜上的受體(PBAN receptor，PBANR)結(jié)合，然后經(jīng)過(guò)一系列的信號(hào)傳遞，最終導(dǎo)致性信息素的合成和分泌．目前對(duì)于PBAN作用機(jī)制的研究多集中在模式生物家蠶(Bombyx mori)中［7］．在家蠶中，PBAN首先和PBANR結(jié)合，促進(jìn)鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，內(nèi)流的 Ca2+與鈣調(diào)素蛋白(CaM)結(jié)合［8］，直接或間接激活Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II(BmCaMKII)，通過(guò)去磷酸化激活?；鵆oA還原酶和酯酶等過(guò)程，最終成功合成蠶蛾醇［9，10］．目前對(duì)SERCA基因的研究主要集中在人類(lèi)、小鼠和其他一些動(dòng)物，在昆蟲(chóng)特別是家蠶中，其在PBAN信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)途徑中的作用還沒(méi)有相關(guān)研究［11］．本試驗(yàn)主要運(yùn)用熒光定量PCR(RT-PCR)的方法，對(duì)SERCA基因在家蠶不同發(fā)育期和不同組織中的表達(dá)情況以及斷頭處理和保幼激素處理后的轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行研究．這些結(jié)果為進(jìn)一步研究SERCA基因在PBAN調(diào)控的性信息素合成與釋放信號(hào)傳導(dǎo)途徑的功能提供理論依據(jù)．

1 材料與方法

1．1 供試?yán)ハx(chóng)

家蠶品種為鎮(zhèn)珠×春蕾，卵由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院內(nèi)鄉(xiāng)蠶業(yè)研究所提供，在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)幼蟲(chóng)，溫度為(26±1)℃，光周期為L(zhǎng):D=16:8，相對(duì)濕度為75%．幼蟲(chóng)化蛹后區(qū)分雌雄．

1．2 主要試劑

總RNA抽提試劑RNAiso Reagent(Invitrogen，USA)，PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser、2 × Power Taq PCR MasterMix、DL2000 Marker、DNA Fragment Purification Kit Ver．2，0 及熒光定量試劑盒(SYBR Primer script RT-PCR Kit)均購(gòu)自TAKARA公司．其他均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?/p>

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 序列分析 核苷酸序列分析采用ChromasPro軟件，氨基酸序列分析采用高級(jí)生物信息學(xué)在線(xiàn)工具 http://www．expasy．org/tools/pi_tool．html，同源性比較采用NCBI中的BLAST工具，序列多重聯(lián)配采用ClustalW和Genedoc軟件，進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建選用MAGE4．0軟件．

1．3．2 引物設(shè)計(jì) BmSERCA基因在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(SilkDB)上的Gene ID是BGIBMGA006603－TA．利用DNAClub軟件設(shè)計(jì)引物，正向引物為SERCA F1:5’-AAAGAAACGCCGAATCTGC-3’，反向引物為 SERCA R1:5’-TGATAAGGCGAATGTCAGCAG-3’．以家蠶核糖體蛋白基因49(Ribosomal protein，Rp49)作為內(nèi)參基因，正向引物為RpF1:5’-CAGGCGGTTCAAGGGTCAATAC-3’，反向引物為 RpR1:5’-TGCTGGGCTCTTTCCACGA-3’．引物由上海生工生物工程有限公司合成．

1．3．3 總RNA提取 包括家蠶雌蟲(chóng)性信息素腺體不同發(fā)育時(shí)期和成蟲(chóng)不同組織的提取兩部分內(nèi)容．其中雌蟲(chóng)性信息素腺體分為－96，－72，－48，－24，0，24，48，72 h 共 8 個(gè)發(fā)育階段;成蟲(chóng)取羽化當(dāng)天的成蟲(chóng)，分別取頭、體壁、卵、中腸、飛行肌、脂肪體等不同組織．將不同發(fā)育時(shí)期的腺體和不同組織分別放入經(jīng)DEPC處理過(guò)的Eppendorf管中勻漿，參照Takara公司試劑說(shuō)明書(shū)，用RNAiso Reagent法提取總RNA．用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其純度和濃度．根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，以家蠶不同發(fā)育時(shí)期的性信息素腺體和不同組織的總RNA為模板合成cDNA第1鏈備用．

1．3．4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Real-time PCR采用相對(duì)定量的計(jì)算方法，家蠶Rp49基因作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照，在Mastercycler@ep realplex real-time PCR檢測(cè)系統(tǒng)上進(jìn)行操作，反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，68 ℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)．SYBR Green PCR信號(hào)的特異性可以使用溶解曲線(xiàn)分析和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)．基因的相對(duì)表達(dá)量用 2－ΔΔCT方法計(jì)算［12］．

1．3．5 BmSERCA基因的時(shí)空表達(dá) 利用合成的不同發(fā)育時(shí)期該基因的cDNA第1鏈作為模板，以SERCA F1和 SERCA R1為引物進(jìn)行 Real-time PCR擴(kuò)增，以Rp49作標(biāo)準(zhǔn)化對(duì)照．相對(duì)定量計(jì)算方法同 1．3．4．

以合成的不同組織的cDNA第1鏈為模板，利用SERCA F1和SERCA R1引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;隨后35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min;最后72℃延伸10 min，然后4℃保存．利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，經(jīng)EB染色后使用GenDoc凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察并照相．

1．3．6 斷頭試驗(yàn) 將不同發(fā)育階段(－72，－48，－24，0 h)的家蠶雌蟲(chóng)斷頭，斷頭處理后 24，48，72 h分別解剖家蠶性信息素腺體．提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈后進(jìn)行熒光定量分析．總RNA提取和隨后反轉(zhuǎn)錄的方法同1．3．3，以正常發(fā)育階段的雌蟲(chóng)性信息素腺體作為對(duì)照．Real-time PCR 操作和計(jì)算方法同1．3．4．

1．3．7 體外保幼激素處理 將不同發(fā)育階段( －72，－48，－24，0 h)的家蠶雌蟲(chóng)斷頭，斷頭處理后24 h解剖性信息素腺體，解剖的性信息素腺體放入含有1 mL Grace’s medium昆蟲(chóng)培養(yǎng)液的組織培養(yǎng)板中，培養(yǎng)1 h后更換為新的Grace’s昆蟲(chóng)培養(yǎng)液(含有2 μmol的保幼激素)．收集不同孵育間隔期(0，2，4 ，6 h)的性信息素腺體，提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，進(jìn)行熒光定量分析．提取總 RNA和反轉(zhuǎn)錄的方法同 1．3．3，Real-time PCR 操作和計(jì)算方法同1．3．4．

1．3．8 統(tǒng)計(jì)分析 RT-PCR的試驗(yàn)均重復(fù)3次，平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差分析結(jié)果．使用t測(cè)驗(yàn)分析不同轉(zhuǎn)錄水平的RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果．

2 結(jié)果與分析

2．1 BmSERCA基因的序列分析

序列分析結(jié)果表明，BmSERCA基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為2865 bp，編碼954個(gè)氨基酸．利用生物信息學(xué)在線(xiàn)工具(http://www．expasy．org/tools/Pi_tool．html)分析氨基酸序列，結(jié)果表明，該蛋白的分子量為104．6 kD，等電點(diǎn)為5．40．將 12種昆蟲(chóng)的SERCA基因氨基酸序列進(jìn)行多重聯(lián)配，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)．結(jié)果表明BmSERCA基因的氨基酸序列與其他昆蟲(chóng)的SERCA基因的氨基酸序列具有較高的一致性(圖1)，其中與煙蚜夜蛾Heliothis virescens的一致性達(dá)到97%，與帝王斑蝶Danaus plexippus的一致性達(dá)到96%，與其他昆蟲(chóng)的序列一致性也都在85%以上(圖2)．

2．2 BmSERCA基因的時(shí)空表達(dá)情況

2．2．1 家蠶不同發(fā)育時(shí)期SERCA基因的表達(dá)情況 Real-time PCR結(jié)果顯示，SERCA基因在家蠶羽化當(dāng)天的表達(dá)量最高，羽化前96 h表達(dá)量最低，從羽化前96 h到羽化0 h其表達(dá)量呈上升趨勢(shì)(圖3)．

2．2．2 家蠶不同組織中SERCA基因的表達(dá)情況

Real-time PCR結(jié)果顯示，SERCA基因在性信息素腺體、頭、體壁、脂肪體、飛行肌、卵中均有表達(dá)，但是在卵中的表達(dá)量相對(duì)較低，在中腸中不表達(dá)(圖4)．

2．3 斷頭處理對(duì)BmSERCA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

斷頭試驗(yàn)結(jié)果表明，該基因在－72，－48，－24 h斷頭處理后轉(zhuǎn)錄水平仍然呈顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是在0 h斷頭后其轉(zhuǎn)錄水平卻顯著下降．與正常發(fā)育階段的雌蟲(chóng)性信息素腺體相比，斷頭處理明顯抑制了BmSERCA基因的表達(dá)(圖5)．

2．4 體外保幼激素處理結(jié)果

保幼激素處理結(jié)果表明，保幼激素明顯抑制了BmSERCA基因在各個(gè)階段斷頭24 h后的轉(zhuǎn)錄水平，特別是－48 h和0 h斷頭后的轉(zhuǎn)錄水平(圖6)．

3 討論

離子的跨細(xì)胞膜運(yùn)輸是引起生物組織中電流的主要原因［13］．LEE［14］解釋了 Ca2+-ATPase 和鈣離子通道中的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)，并研究了鈣離子的主動(dòng)和被動(dòng)運(yùn)輸過(guò)程．TOYOSHIMA等［15］對(duì)鈣離子傳輸?shù)慕Y(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、可能的傳輸通道以及抑制劑的作用進(jìn)行了闡述．試驗(yàn)證明細(xì)胞中鈣離子和鎂離子、鈉離子、鉀離子的濃度相差數(shù)萬(wàn)倍的情況下，Ca2+-ATPase依然會(huì)選擇性的吸收鈣離子［16］．肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣離子橫跨膜運(yùn)輸是在鈣泵作用下通過(guò)鈣離子通道運(yùn)輸鈣離子的過(guò)程，它的活性的大小可以反應(yīng)出各種細(xì)胞能量代謝和功能的強(qiáng)弱［17］．本研究中，肌質(zhì)/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜 Ca2+-ATPase在家蠶中的時(shí)空表達(dá)情況表明，該基因在羽化前4 d表達(dá)量相對(duì)較低，羽化前隨著時(shí)間的推移其表達(dá)量一直在上升，并在羽化當(dāng)天表達(dá)量達(dá)到最高．這種表達(dá)模式與性信息素合成的關(guān)鍵基因保持一致［18，19］．家蠶的性信息素的主要成分是蠶蛾醇，其前體物質(zhì)主要以Triacylglycerols(TAGs)的形式存

圖1 BmSERCA和其他昆蟲(chóng)SERCA的氨基酸序列多重聯(lián)配Fig．1 Amino acid sequence multiple alignment of BmSERCA with other insects homologs

黑色代表100%一致性;灰色代表80%一致性;白色代表小于80%一致性．BM．家蠶;DP．帝王斑蝶;HV．煙蚜夜蛾;BT．大黃蜂;AM．意大利蜜蜂;NV．麗蠅蛹集金小蜂;AP．豌豆蚜;TC．赤擬谷盜;AA．埃及伊蚊;AG．瘧蚊;CQ．庫(kù)蚊;DM．黑腹果蠅．下同．

The black represents 100%identity;The gray represents 80%identity;The white represents less than 80%identity．BM．Bombyx mori(NP_001157948．1);DP．Danaus plexippus(EHJ69709．1);HV．Heliothis virescens(AAD09820．1);BT．Bombus terrestris(XP_003399858．1);AM．Apis mellifera(XP_393851．3);NV．Nasonia vitripennis(XP_001603571);AP．Acyrthosiphon pisum(XP_001943129);TC．Tribolium castaneum(XP_966783．1);AA．Aedes aegypti(XP_316251．4);AG．Anopheles gambiae(XP_316251．4);CQ．Culex quinquefasciatus(XP_001868188．1);DM．Drosophila melanogaster(NP_726381．1)．The same as below．

圖6 保幼激素處理對(duì)BmSERCA基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig．6 The effect of JH treatment on the transcription levels of BmSERCA gene

A．家蠶雌蟲(chóng)羽化前72 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平;B．家蠶雌蟲(chóng)羽化前48 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平;C．家蠶雌蟲(chóng)羽化前24 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平;D．家蠶雌蟲(chóng)羽化前0 h斷頭，斷頭24 h后JH處理0，2，4，6 h后BmSERCA基因的轉(zhuǎn)錄水平．?dāng)?shù)據(jù)均代表3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，＊＊和＊＊表示處理與對(duì)照(0 h)之間t－測(cè)驗(yàn)差異顯著(*:0．01 ＜P ＜0．05 ，＊＊:P ＜0．01)．

A．The females at 72 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0，2，4 h and 6 h)after head detachment 24 h;B．The females at 48 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0 ，2 ，4 h and 6 h)after head detachment 24 h;C．The females at 24 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0，2，4 h and 6 h)after head detachment 24 h;D．The females at 0 h before-eclosion were decapitated．The transcription levels of BmSERCA gene after JH treatment(0，2，4 h and 6 h)after head detachment 24 h．The data represent the mean ± SE of three biological replicates，Significance of pairwise comparisons(treatment vs control)are marked with*or＊＊ (*:0．01 ＜P ＜0．05; ＊＊:P ＜0．01)as determined by the Student’s t-test．在于家蠶細(xì)胞質(zhì)脂滴中．脂滴在成蟲(chóng)羽化前3 d或4 d開(kāi)始出現(xiàn)，在成蟲(chóng)羽化當(dāng)天快速積聚，達(dá)到最高值［20，21］．雌成蟲(chóng)在羽化當(dāng)天即產(chǎn)生大量的性信息素［22］．PBAN在成蟲(chóng)羽化之后，從腦－咽下神經(jīng)節(jié)合成，經(jīng)咽側(cè)體釋放到血淋巴中，然后直接作用于性信息素腺體細(xì)胞促進(jìn)性信息素生物合成的許多步驟［23，24］．鈣離子在 PBAN 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)途徑中起著重要的作用，阻斷鈣離子的流入將會(huì)打斷PBAN信號(hào)向下游的傳導(dǎo)［25］．而SERCA的主要功能是Ca2+的運(yùn)輸，是否PBAN激活Ca2+后由SERCA來(lái)運(yùn)輸Ca2+還需進(jìn)一步的研究．

SERCA基因在性信息素腺體、頭、體壁、脂肪體、飛行肌、卵中均有表達(dá)，但是在卵中的表達(dá)量相對(duì)較低，在中腸中不表達(dá)．該基因在－72，－48，－24 h斷頭處理后轉(zhuǎn)錄水平仍然呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但是在0 h斷頭后其轉(zhuǎn)錄水平卻顯著下降，這與該基因在正常發(fā)育階段的表達(dá)趨勢(shì)是一致的．但與正常發(fā)育階段的雌蟲(chóng)性信息素腺體相比，斷頭對(duì)BmSERCA基因的表達(dá)有明顯的抑制作用．體外保幼激素處理試驗(yàn)中，運(yùn)用斷頭雌蛾的主要原因是排除內(nèi)保幼激素的影響．RT-PCR的結(jié)果表明，保幼激素明顯的抑制了該基因在各個(gè)階段斷頭24 h后的轉(zhuǎn)錄水平，特別是－48 h和0 h斷頭后的轉(zhuǎn)錄．在家蠶從蛹到成蟲(chóng)的發(fā)育過(guò)程中，保幼激素的滴度也隨之增加，特別是交配后，保幼激素的滴度大幅增加，交配后的家蠶不再產(chǎn)生性信息素．本研究為進(jìn)一步研究PBAN調(diào)控性信息素合成與釋放的整個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑提供理論依據(jù)．但是Ca2+-ATPase和鈣離子通道在PBAN調(diào)控性信息素合成與釋放信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑中的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步闡釋?zhuān)?/p>

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