魏文松，穆琳瑛，李會芹，王 順，李宏偉，侯金博，江 敏，胡建東

(1．河南農(nóng)業(yè)大學機電工程學院，河南鄭州450002;2．河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司，河南鄭州450002;3．河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002)

現(xiàn)實生活中有大量危害環(huán)境和人類健康的化 學品不斷釋放到自然環(huán)境中，其中大部分為有機合成物，它們在環(huán)境中性質(zhì)穩(wěn)定，存留時間長，有較強的生物蓄積毒性甚至有致癌、畸形和致突變等作用，給人類及環(huán)境帶來極大的危害［1］．其中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental endocrine disruptors，EEDs)中的環(huán)境雌激素(Environmental estrogens，EEs)已成為環(huán)境科學工程研究領(lǐng)域中的一大熱點．環(huán)境雌激素是進入動物體后，具有干擾體內(nèi)正常內(nèi)分泌物質(zhì)的合成、釋放、運輸、結(jié)合、代謝等過程，激活或抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，從而破壞維持機體穩(wěn)定性和調(diào)控作用的化合物，包括人工合成化合物及植物天然雌激素．環(huán)境雌激素中的雌二醇進入人體后，干擾人體內(nèi)正常激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運、結(jié)合、活性反應(yīng)、代謝、消解或產(chǎn)生類似生物體自身激素樣的作用，對生物體維持自身內(nèi)環(huán)境的動態(tài)平衡、繁殖、生長及行為產(chǎn)生不利的影響，它有明顯的致癌性［2，3］，因而對于環(huán)境雌激素的檢測對于人類和環(huán)境都有著極其重要的作用．傳統(tǒng)的環(huán)境雌激素檢測方法主要有氣相色譜法，液相色譜法，氣相色譜－質(zhì)譜法，液相色譜－質(zhì)譜法，熒光分子傳感法等［4］．近年來發(fā)展起來的光學表面等離子共振技術(shù)在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、藥物篩選和生物醫(yī)學等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，與傳統(tǒng)的方法相比具有無需標記、非破壞性、快速且能夠?qū)崿F(xiàn)實時檢測等特點［5～8］．利用光學表面等離子共振技術(shù)，采用競爭抑制方法［9］，作者設(shè)計了一種新穎的、無標記、基于光學表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)生物傳感檢測系統(tǒng)，并用于檢測環(huán)境雌激素中雌二醇，為環(huán)境雌激素中雌二醇的快速定量檢測提供了一種新穎的方法．

1 材料與方法

1．1 材料與儀器

十二烷基硫酸鈉 (SDS)(美國Sigma公司)，N－羥基琥珀酰亞胺(NHS)(美國Sigma公司)，1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基炭二亞胺鹽酸鹽(EDC)(美國Sigma公司)，巰基丙酸(MPA)，乙醇胺(ETH)，PBS緩沖液，牛血清白蛋白(BSA)，含0.1%SDS的 0．1 mol·L－1的 NaOH，N，N'－ 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，二甲亞砜(DMSO)，雌二醇標準品，雌二醇單克隆抗體，高氯酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉、去離子水．所有試劑均為分析純．

光學SPR生物傳感器TSPR1K23從美國Ti公司購買，內(nèi)部集成封裝了光學檢測系統(tǒng)．集成光學SPR生物傳感器TSPR1K23表面蒸鍍50 nm金膜，用于產(chǎn)生表面等離子共振光譜．微流池、便捷式更換芯片夾具、觸摸屏、光電轉(zhuǎn)換電路、USB接口板和動力學分析軟件均由河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司研制［10］．

1．2 光學SPR檢測環(huán)境雌激素中雌二醇的原理

光學表面等離子共振(SPR)生物傳感器檢測環(huán)境雌激素中雌二醇的原理實質(zhì)是檢測結(jié)合在金膜表面的分子質(zhì)量，其原理是將特定波長的光束以一定角度入射到表面蒸鍍50 nm金膜的光學基板上，光線從棱鏡與金膜界面產(chǎn)生全反射，全反射產(chǎn)生的倏逝波引起金膜內(nèi)的自由電子產(chǎn)生運動，形成表面等離子波．當表面等離子波的傳播常數(shù)與入射光波的傳播常數(shù)相等時，表面等離子波與倏逝波將產(chǎn)生共振，共振時反射光信號在線陣CCD上的產(chǎn)生1個光強最弱的點(用像素點位置表示)，隨著抗原抗體的結(jié)合，像素位置點發(fā)生變化，這是由于結(jié)合在金膜表面的分子質(zhì)量的變化，從而導致發(fā)生光學SPR共振角度變化，對應(yīng)到CCD的像素位置發(fā)生變化，因此像素點的位置與附著在光學芯片表面的質(zhì)量有關(guān)．本實驗采用競爭抑制方法檢測金膜表面微小的質(zhì)量變化，從而可以獲得被測樣品中物質(zhì)含量［11］．光學SPR生物傳感器競爭抑制法原理如圖1所示．

圖1 光學SPR生物傳感器競爭抑制法Fig．1 Schematic of competitive immunological detection method

將雌二醇分子通過巰基丙酸固定在傳感器金膜上制成分子識別膜．分析時先進行預(yù)反應(yīng)，預(yù)反應(yīng)時在樣本中加入定量的雌二醇抗體分子，雌二醇抗體抗體和樣本混合后孵育，使樣本中雌二醇分子和雌二醇抗體分子結(jié)合達到平衡狀態(tài)，之后再通過光學SPR生物傳感器表面分子識別膜檢測未被結(jié)合的自由抗體分子，抗原濃度越高，分子識別膜上結(jié)合自由抗體分子越少，即結(jié)合的分子質(zhì)量與樣本中抗原質(zhì)量濃度成反比關(guān)系．

2 光學SPR生物傳感檢測系統(tǒng)的設(shè)計

該光學SPR生物傳感檢測系統(tǒng)的核心是集成光學 SPR 生物傳感器 TSPR1K23［12，13］．它采用的是固定角檢測模式，將線陣CCD和LED用不透明的材料封裝起來，SPR角的變化則由不同像素位點上信號強度的變化表示．圖2為光學SPR生物傳感系統(tǒng)原理框圖．該系統(tǒng)由以下幾個部分組成．(1)集成光學SPR生物傳感器TSPR1K23．(2)微流池．由3個微流道構(gòu)成．(3)蠕動泵．用于對流速精密控制．(4)微電子驅(qū)動器．通過驅(qū)動器控制蠕動泵將樣品傳送到微流池．(5)半導體溫度檢測裝置．用于微流池內(nèi)樣品溫度控制．(6)ECB板．內(nèi)嵌一個A/D轉(zhuǎn)換器和2個微處理器:第1個微處理器用來采集線陣CCD的光強信號和對信號進行濾波處理，并根據(jù)溫度檢測裝置對微流池內(nèi)樣品的溫度進行控制，使其保持在(25±0．5)℃;第2個微處理器通過USB接口發(fā)送數(shù)據(jù)到觸摸屏，由觸摸屏完成光學SPR響應(yīng)信號分析、曲線生成和生物分子動態(tài)結(jié)合和解離分析．

圖2 光學SPR生物傳感系統(tǒng)構(gòu)建原理圖Fig．2 Schematic configuration of the optical SPR biosensor system

2．1 信號處理電路設(shè)計

信號處理電路由嵌入式系統(tǒng)［14］、ECB信號處理電路板、半導體溫度控制器、A/D轉(zhuǎn)換器、4501放大器和觸摸屏等部分組成［15～18］．信號處理電路如圖3所示．

圖3 信號處理電路原理框圖Fig．3 Circuit diagram of signal processing

處理電路中用2個電源為電路供電，其中電源1為 5 V，為觸摸屏、光學 SPR生物傳感器TSPR1K23和半導體溫度控制器提供電源;電源2為3 V，為4501放大器、A/D轉(zhuǎn)換器和ECB電路板提供電源．處理過程如下:由光學SPR生物傳感器TSPR1K23反射出的光強信號由線陣CCD采集到，經(jīng)由4501運算放大器放大后，通過A/D轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，傳輸?shù)紼CB電路板進行處理，ECB電路處理電路由觸摸屏控制系統(tǒng)控制，在觸摸屏上完成對信號和數(shù)據(jù)的實時動力學分析和存儲，利用嵌入式系統(tǒng)進行曲線擬合得到RU－t曲線［19］．同時ECB電路板中的微處理器控制半導體溫度控制器來控制和調(diào)節(jié)流通池系統(tǒng)的溫度為恒溫，包括制冷和制熱2個方向，當系統(tǒng)溫度超過25℃時，制冷模式啟動，降溫．反之，溫度低于25℃時，制熱模式啟動，升溫．使系統(tǒng)溫度維持在(25±0．5)℃范圍，保證檢測結(jié)果不受溫度影響．

3 分子敏感膜的制備

3．1 傳感器的清洗

采用4%的十二烷基硫酸鈉(SDS)對傳感器進行超聲清洗5 min，之后用去離子水沖洗干凈，最后用N2吹干待用．

3．2 金膜表面敏感膜制備

(1)取適量BSA滴于金膜上，靜置反應(yīng)約4 h．(2)用溶于DMSO的DCC和NHS混合物活化雌二醇約1 h后，滴于金膜表面，靜置反應(yīng)過夜．(3)用1 mol·L－1乙醇胺封閉約 20 min．(4)將制備好的敏感膜浸泡在PBS液中，放置冰箱內(nèi)保．(4)此時完成敏感膜的制備．每一步之后都要用PBS緩沖液清洗，所有步驟均在室溫下進行．

4 結(jié)果與分析

4．1 標準曲線的建立

將抗體濃度稀釋后與不同質(zhì)量濃度抗原混合(25，50，100，200 mg·L－1)，對混合物依次進行測試得到一定時間段t內(nèi)不同抗原質(zhì)量濃度的響應(yīng)值(RU)的關(guān)系(圖4)．隨著抗原質(zhì)量濃度依次增加，其響應(yīng)值依次減小，即抗原質(zhì)量濃度越大發(fā)生共振的時候光強越弱．從圖4可以看出，信號響應(yīng)值隨抗原添加量的增加而減少，符合競爭抑制性檢測規(guī)律，且各質(zhì)量濃度間具有很好的區(qū)分度．

圖4 含不同質(zhì)量濃度雌二醇樣品的信號響應(yīng)值Fig．4 Response value of different concentrations of estradiol antigen samples in the same amount of time

在圖4中取適當時間點不同質(zhì)量濃度雌二醇樣品的響應(yīng)值，并與所對應(yīng)的抗原質(zhì)量濃度作圖，如圖5所示．

對該響應(yīng)結(jié)果做曲線擬合，其線性方程為:△RU=5 200．4 －0．256C，相關(guān)系數(shù)為 0．997 8．由此可知，當抗體稀釋后，儀器響應(yīng)值和雌二醇質(zhì)量濃度成反比關(guān)系，并且具有很好的線性關(guān)系．由此建立了利用光學SPR技術(shù)采用競爭抑制方法檢測雌二醇的標準曲線．

圖5 不同標準質(zhì)量濃度雌二醇抗原的響應(yīng)值擬合直線Fig．5 A fitting curve of SPR response values with different standard estradiol antigen mass concentrations

5 結(jié)論

本研究基于環(huán)境中生物毒素檢測新方法的需求，建立了一種基于光學表面等離子共振生物傳感檢測系統(tǒng)，該生物傳感檢測系統(tǒng)由集成光學SPR生物傳感器、微流池、便捷更換芯片夾具、觸摸屏、信號處理電路和USB接口板組成，結(jié)構(gòu)簡單，造價低廉，操作方便，用于環(huán)境雌激素中雌二醇檢測的研究．檢測方法基于雌二醇抗體和雌二醇抗原競爭抑制法．分別將 25，50，100，200 mg·L－1的雌二醇添加入雌二醇抗體溶液中進行競爭反應(yīng)，將反應(yīng)后的分析物流經(jīng)光學SPR芯片表面，建立了雌二醇測定標準曲線，其相關(guān)系數(shù)為0．9978．檢測結(jié)果顯示，該傳感檢測系統(tǒng)具有較好的穩(wěn)定性和可操作性，驗證了光學表面等離子共振生物傳感器及生物檢測系統(tǒng)的性能，不僅為環(huán)境雌激素中雌二醇的快速定量檢測提供了一種新穎的方法，也是對現(xiàn)有檢測系統(tǒng)功能的延伸和新系統(tǒng)不斷創(chuàng)新的新起點．

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