馬羽萍 張殿增 張新昀 劉 莉 趙 玲 彭 杰 黃小正 郭雅玲

陜西省傳染病院（西安710061）

腸源性內(nèi)毒素血癥，在臨床疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著非常重要的作用[1]。腸源性內(nèi)毒素血癥可引起肝臟持續(xù)性損害，是加速和促使肝硬化形成的原因之一，也是促使肝硬化并發(fā)癥形成的重要原因，嚴(yán)重影響肝硬化患者的生存及預(yù)后[2]。肝硬化患者腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率較高。前期我們通過(guò)運(yùn)用復(fù)方中藥解毒灌腸液治療重型肝炎和肝硬化患者合并內(nèi)毒素血癥的臨床研究，發(fā)現(xiàn)該方藥能改善臨床癥狀，降低內(nèi)毒素，改善肝功能，減少并發(fā)癥[3]。本研究通過(guò)家兔肝硬化模型動(dòng)物造模，觀察復(fù)方中藥解毒灌腸液對(duì)其血液內(nèi)毒素水平、肝組織炎性細(xì)胞因子、病理切片變化及肝腎功能的影響，探討該方藥對(duì)內(nèi)毒素血癥動(dòng)物的保護(hù)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 解毒灌腸液 大黃1500g，金銀花、蒲公英、丹參、赤芍、白頭翁各1000g，枳實(shí)、厚樸各500g。制成濃縮煎液（比重為1.04—1.05），高壓滅菌，分裝（200mL/瓶）。本制劑所用藥材的生藥鑒定均按照中國(guó)藥典2000版一部有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定進(jìn)行。

1.2 試劑 內(nèi)毒素脂多糖（LPS），Sigma Chemical Co.產(chǎn)品（批號(hào)L2880。抗兔內(nèi)毒素（批號(hào)：2011111033）和抗兔TNF－α（批號(hào)：20111109046）Elisa試劑盒均購(gòu)自天津索羅門(mén)生物科技有限公司。頭孢克肟片為江蘇正大清江制藥有限公司生產(chǎn)，乳果糖為安維世制藥（北京）有限公司生產(chǎn)。四氯化碳為廣東光華化學(xué)廠有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：20091015），用時(shí)以高壓消毒過(guò)的色拉油配制成50%的溶液。生化檢測(cè)在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)健康雄性家兔，6月齡，體重1.9±0.5kg，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，在層疊式自動(dòng)沖水不銹鋼籠內(nèi)飼養(yǎng)，供自來(lái)水和兔標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由攝食飲水。

2 方法 取SPF級(jí)健康雄性家兔42只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，耳中動(dòng)脈采血后，所有動(dòng)物以0.1mL/㎏劑量用一次性注射器腹腔注射四氯化碳。每3d1次，連續(xù)90d。肝硬化造模結(jié)束后，將存活的40只動(dòng)物隨機(jī)分為四組：3個(gè)對(duì)照組，即生理鹽水、乳果糖、頭孢克肟灌腸組；1個(gè)實(shí)驗(yàn)組，即解毒灌腸液灌腸組。于注射四氯化碳結(jié)束前兩周分別用生理鹽水、乳果糖、頭孢克肟和解毒灌腸液進(jìn)行保留灌腸，容積為10mL/只，每日1次；灌腸結(jié)束12h后，用內(nèi)毒素LPS灌胃（40μg/kg）1次，持續(xù)2周。末次LPS灌胃2h后，心臟采血，測(cè)定肝腎功能相關(guān)的生化指標(biāo)、血液學(xué)指標(biāo)、血液內(nèi)毒素水平和TNF－α水平。然后脫臼處死動(dòng)物，摘取心、肝、脾、腎和大腦稱(chēng)濕重，計(jì)算臟體比。摘取大腸，稱(chēng)濕重后在105℃烤箱內(nèi)烘干，稱(chēng)干重，計(jì)算其干濕比。最后將心、肝、脾、腎和大腸標(biāo)本用10%甲醛固定，常規(guī)切片，進(jìn)行病理學(xué)檢查。

3 結(jié)果

3.1 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔肝腎功能的影響于造模前和內(nèi)毒素灌胃后分別于耳中動(dòng)脈和心臟采血，用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)動(dòng)物的血液生化學(xué)指標(biāo)，結(jié)果如表1示。

表1 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔肝腎功能的影響（±s）

表1 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔肝腎功能的影響（±s）

與生理鹽水組比較，△P＜0.05，＊P＜0.05，△△P＜0.05；與乳果糖組比較，＊＊P＜0.05；與頭孢克肟組比較，＃P＜0.05。

生理鹽水組 乳果糖組 頭孢克肟組 解毒灌腸液組AST（U/L） 10 92.77±34.51 79.77±40.97 91.05±35.85 59.13±12.38△△＃組別/項(xiàng)目 n 10 2.79±1.02 2.57±0.78 2.86±1.02 3.18±0.81 ALT（U/L） 10 95.15±24.88 102.45±57.28 92.17±18.23 58.43±11.10△△＊＊＃ALP（U/L） 10 159.90±27.79 102.12±55.67△ 99.07±57.35 57.42±6.54△△＊＊＃CHOL（mM/L） 10 4.77±2.12 5.04±2.43 5.82±2.38 4.23±2.25△△TP（g/L） 10 61.93±5.28 62.15±5.57 61.95±5.53 66.50±1.30△△＊＊＃ALB（g/L） 10 34.60±3.84 35.07±4.43 34.85±4.22 38.38±1.43△△＊＊＃BUN（mM/L） 10 12.43±4.04 6.27±1.38 6.12±1.57 5.52±1.10△△CREA（μM/L） 10 155.28±33.34 77.75±8.17△ 72.30±6.37＊ 72.30±6.25△△TG（mM/L）

表1中的結(jié)果表明，與生理鹽水組比較，乳果糖組中肝、腎功能多指標(biāo)明顯改善，解毒灌腸液組中肝、腎功能指標(biāo)普遍較對(duì)照組明顯改善。

表2 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔血液學(xué)的影響±s）

表2 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔血液學(xué)的影響±s）

與生理鹽水組比較，各組血常規(guī)指標(biāo)無(wú)明顯差異，P＞0.05；與頭孢克肟組比較，＃P＜0.05。

生理鹽水組 乳果糖組 頭孢克肟組 解毒灌腸液組RBC（1012/L）10 5.28±1.17 5.08±0.78 6.05±1.00 4.91±0.73組別/項(xiàng)目 n＃HGB（g/L） 10 117.83±16.68 119.33±16.52 130.0±12.20 114.00±13.97＃WBC（109/L）10 3.92±2.60 3.10±2.51 3.44±2.50 2.86±2.50 LYMP（%） 10 69.33±17.12 71.13±16.20 79.22±4.70 70.68±18.26 NEUT（%） 10 26.48±17.41 26.22±16.31 17.62±4.94 26.67±17.27

表2中的結(jié)果顯示，各組的血液學(xué)指標(biāo)較模型對(duì)照組沒(méi)有明顯差別，說(shuō)明給藥后模型動(dòng)物的血液學(xué)指標(biāo)沒(méi)有明顯的改變。

表3 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔血清TNF－α和ET水平的影響±s）

表3 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔血清TNF－α和ET水平的影響±s）

與生理鹽水組比較，△P＜0.05，＊P＜0.05，△△P＜0.05；解毒灌腸液組與乳果糖組及頭孢克肟組比較，＊＊P＜0.05，＃P＜0.05。

生理鹽水組 乳果糖組 頭孢克肟組 解毒灌腸液組TNF－α（ng） 10 424.27±87.25 313.26±65.64△ 315.68±45.73＊ 220.87±103.61＊＊△△＃組別/項(xiàng)目 n ET（pg/mL） 10 165.87±42.36 85.72±42.46△ 137.32±40.77 65.50±28.82△△＃

表3顯示，與生理鹽水組比較，各組動(dòng)物血清TNF－α、ET水平明顯降低；與乳果糖組及頭孢克肟組比較，解毒灌腸液組動(dòng)物血清TNF－α、ET水平降低更為明顯（P＜0.05）。

表4 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔臟體比的影響±s）

表4 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔臟體比的影響±s）

與生理鹽水組比較，各組動(dòng)物臟體平均重量無(wú)明顯差異，P＞0.05；與乳果糖組比較，＊＊P＜0.05。

組別 n 體重臟體比心臟（g） 肝臟（g） 脾臟（g） 腎臟（g） 腦（g）7.20±1.41 3.20±0.61乳果糖組 10 2.32±.019 2.35±028 39.43±8.88 1.19±0.17 6.68±1.06 3.13±0.20頭孢克肟組 10 2.17±0.21 2.42±0.31 39.87±2.95 1.16±0.29 7.44±0.80 3.25±0.63解毒灌腸液組 10 2.28±0.19 2.34±0.30 37.83±2.76 1.03±0.16＊＊生理鹽水組 10 2.37±0.32 2.31±0.35 38.78±5.83 1.14±0.28 7.00±0.92 2.96±0.49

表4中的結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，各組動(dòng)物臟體平均重量沒(méi)有明顯的差別（P＞0.05）。說(shuō)明造模與給藥對(duì)動(dòng)物的臟體平均重量沒(méi)有明顯的影響。

表5 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔大腸干濕比的影響（±s）

表5 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔大腸干濕比的影響（±s）

與生理鹽水組比較，△P＜0.05，＊P＜0.05，△△P＜0.05；解毒灌腸液組與乳果糖組比較，＊＊P＜0.05，與頭孢克肟組比較，＃P＜0.05。

10 2.37±0.32 62.58±6.66 7.05±0.52 0.11±0.02乳果糖組 10 2.32±.019 45.70±3.03△ 6.47±80.38 0.14±0.02△頭孢克肟組 10 2.17±0.21 44.95±3.80＊ 6.22±0.49＊ 0.13±0.01解毒灌腸液組 10 2.28±0.19 38.07±4.02△△＊＊＃ 6.46±0.41 0.17±0.01△△＊＊＃干濕比生理鹽水組組別 動(dòng)物數(shù)（n） 體重（kg） 濕重（g） 干重（g）

表5中的結(jié)果顯示，與生理鹽水組比較，乳果糖組、頭孢克肟組及解毒灌腸液組動(dòng)物大腸的干濕比值明顯增加（P＜0.05）；與乳果糖組、頭孢克肟組比較，解毒灌腸液組動(dòng)物大腸的干濕比值增加更為明顯。說(shuō)明解毒灌腸液對(duì)肝纖維化動(dòng)物大腸具有更強(qiáng)的保護(hù)作用。

3.2 病理檢查

3.2.1 肝臟病理檢查 于LPS灌腸后2h，脫臼處死動(dòng)物，剪取肝臟樣品，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，在顯微鏡下觀察肝臟的病理變化，結(jié)果如圖1所示。

圖1 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔肝臟病理學(xué)的影響 結(jié)果顯示，模型對(duì)照組動(dòng)物的肝細(xì)胞明顯水腫，肝竇明顯擴(kuò)張。竇內(nèi)枯否細(xì)胞明顯濁脹、變形、數(shù)量增多，匯管腫脹、變形，數(shù)量增多較明顯，可見(jiàn)明顯地條索狀纖維化增生，井可見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。乳果糖組、頭孢克肟組見(jiàn)有相同改變，但程度較輕，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。解毒灌腸液組僅見(jiàn)肝細(xì)胞明顯水腫，纖維化增生較少，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于模型對(duì)照組和其他給藥組。HE染色，×400。

3.2.2 大腸病理檢查 于LPS灌腸后2h，脫臼處死動(dòng)物，剪取大腸樣品，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，在顯微鏡下觀家兔大腸的病理變化，結(jié)果如圖2所示。

討 論 腸源性內(nèi)毒素是肝功能衰竭發(fā)生、發(fā)展的主要原因。腸道堪稱(chēng)是內(nèi)毒素的最大儲(chǔ)庫(kù)?；顒?dòng)性肝病時(shí)常伴有門(mén)脈高壓性腸病，其主要表現(xiàn)為血管擴(kuò)張、扭曲、形成交通支、通透性增加（門(mén)脈高壓性腸血管?。衬こ溲?、水腫、糜爛、出血。加之部分病人伴隨的自身免疫性腸病和感染性腸病，這些均可增加腸粘膜通透性，有助于內(nèi)毒素的吸收，增加內(nèi)毒素的攝取，

圖2 解毒灌腸液對(duì)肝纖維化模型家兔大腸病理學(xué)的影響結(jié)果顯示，模型對(duì)照組動(dòng)物的大腸粘膜的炎癥反應(yīng)明顯，血管充血擴(kuò)張，粘膜水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。乳果糖組和頭孢克肟組亦有明顯炎癥反應(yīng)。解毒灌腸組動(dòng)物的大腸粘膜的炎癥反應(yīng)明顯減輕，血管擴(kuò)張和水腫都不明顯。

從而致使肝硬化患者血清中的ET水平明顯增加，肝臟和結(jié)腸、直腸出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，大腸濕重增加[4]。內(nèi)毒素血癥綜合征、肝性腦病，及出血等[5]。常是肝衰竭繼發(fā)多臟器衰竭的始動(dòng)因素。因此腫瘤壞死因子被視為內(nèi)毒素所知肝臟病理生理過(guò)程的關(guān)鍵性促炎物質(zhì)[6]。內(nèi)毒素血癥，從腸道給藥，通過(guò)腸道粘膜吸收，使藥物直達(dá)病所[7]，減少腸源性內(nèi)毒素產(chǎn)生和吸收，降低血漿內(nèi)毒素水平，下調(diào)或抑制損傷性細(xì)胞因子的分泌，改善肝內(nèi)微循環(huán)，減輕內(nèi)毒素對(duì)肝細(xì)胞線粒體的損傷，恢復(fù)正常的肝臟能量代謝，是肝衰竭臨床治療的一條新的思路。

目前在臨床上常采用多種方法以降低血液內(nèi)毒素，如內(nèi)毒素吸附劑乳果糖和抗菌素[9]等，還用一些中藥進(jìn)行灌腸。乳果糖可以①酸化腸腔，減少胺類(lèi)吸收；②調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制腸道嗜堿性有害細(xì)菌生成；③滲透性腹瀉作用，減少ET滯留在腸腔，促進(jìn)腸蠕動(dòng)，減少內(nèi)毒素庫(kù)；④滅活內(nèi)毒素；⑤阻止活化單核巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，減輕免疫反應(yīng)。這些作用可能是它減輕肝硬化內(nèi)毒素血癥模型動(dòng)物肝臟損壞的原因，但它對(duì)腸粘膜沒(méi)有保護(hù)作用，對(duì)已經(jīng)吸收的內(nèi)毒素沒(méi)有清除作用。頭孢克肟則是通過(guò)殺滅腸道和吸收入血的活菌降低血液內(nèi)毒素水平，對(duì)已經(jīng)形成的LPS沒(méi)有作用。所以，它們對(duì)血液ET水平和TNF－α有一定的影響。

本研究結(jié)果顯示，造模形成的肝硬化內(nèi)毒素血癥模型，生理鹽水組比對(duì)照組動(dòng)物的肝腎功出現(xiàn)明顯的異常，血脂代謝失調(diào)，血清TNF－α、ET水平明顯提高，大腸的干濕比明顯減少，肝臟和大腸出現(xiàn)明顯的炎癥病理學(xué)改變。經(jīng)藥物干預(yù)，乳果糖組和頭孢克肟組動(dòng)物的這些改變有些減輕，但不是很明顯。解毒灌腸液組對(duì)動(dòng)物肝纖維化模型家兔肝腎功能及血清TNF－α、ET水平的影響明顯（P＜0.05），大腸的干濕比、肝臟和大腸炎癥病理學(xué)改變與其他給藥組比較明顯。

解毒灌腸液由清熱解毒、通里攻下、活血化瘀的中草藥組成，對(duì)肝硬化內(nèi)毒素血癥的家兔有顯著的保護(hù)作用，其途徑可能通過(guò)保護(hù)腸道屏障作用，改善微循環(huán)，減少腸道內(nèi)毒素的吸收，降低機(jī)體的內(nèi)毒素水平，從而減少炎性因子的產(chǎn)生，阻斷內(nèi)毒素血癥的生物學(xué)效應(yīng)。是治療肝硬化有效的輔助方法之一。

[1]房 杰，孫蘭菊，陳明慧.解生地對(duì)大鼠腸管炎內(nèi)毒血癥防治作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志，2011，40（10）：1455.

[2]R uan P，G ong ZJ，Zhang Q R.C hanges of p lasm a D（－）－lacate，d iam ine ox idase and endotox in in p at ien ts w ith liver cir2rhosis[J].H epatob il Pan creat D is Int，2004，3（4）：456－462.

[3]馬羽萍，彭 杰，趙 玲，等.中西醫(yī)結(jié)合治療重癥型肝炎、肝炎肝硬變合并內(nèi)毒素血癥40例[J].陜西中醫(yī)，2002，23（7）：579.

[4]黃自平.腸源性內(nèi)毒素血癥在肝硬化失代償中的作用及其處理[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)，1997，6（1）：9－24.

[5]張順財(cái).內(nèi)毒素基礎(chǔ)與臨床[M].北京：科學(xué)出版社2003：272.

[6]于中麟，錢(qián)林學(xué).乳果糖在肝病治療中的應(yīng)用[J].中華內(nèi)科雜志，1996，35：65.

[7]毛 毛，大黃解毒灌腸治療慢性乙型病毒性肝炎腸性內(nèi)毒素血癥45例[J].陜西中醫(yī)，2010，31（5）：516.