黃蓬英，林玲玲，洪欽陽，廖富榮廈門出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門3606;福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州35000

米爾頓姬小蜂 Anselmella miltoni Girault，屬膜翅目Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea姬小蜂科Eulophidae Anselmella屬，最早僅分布于澳大利亞，現(xiàn)已擴(kuò)散至我國臺(tái)灣地區(qū)。其幼蟲以取食蒲桃屬Syzygium的種子為生，嚴(yán)重影響水果的產(chǎn)量和食用價(jià)值(黃蓬英等，2008)。2007、2009年廈門檢驗(yàn)檢疫局對(duì)來自臺(tái)灣的蓮霧Eugenia javanica Lam實(shí)施檢疫時(shí)發(fā)現(xiàn)該蟲。目前，有關(guān)米爾頓姬小蜂的研究較少，尤對(duì)其生物學(xué)、種群遺傳等特性缺乏深入的研究。

昆蟲的線粒體基因(mtDNA)大小一般為15.4～16.3 kb。16S rRNA是mtDNA上進(jìn)化速率中等的基因，其序列高度保守，常被用于高級(jí)分類階元的系統(tǒng)進(jìn)化和分類鑒定(黃華平等，2006;龍健和龐虹，2003;蘇成勇等，2007)。線粒體細(xì)胞色素氧化酶第Ⅰ亞基(cytochrome oxidase subunitⅠ，COⅠ)是保守性中等的基因區(qū)段，目前已被廣泛用于昆蟲種間、尤其是種內(nèi)的遺傳變異研究(竇向梅等，2005)。以上述2個(gè)基因片段序列作為DNA條形碼，已成為生物分類領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。迄今為止，有關(guān)米爾頓姬小蜂線粒體16S rRNA和COⅠ基因序列尚未見報(bào)道。本研究通過PCR擴(kuò)增，測定16S rRNA和COⅠ部分序列，并對(duì)其進(jìn)行分析，以期為米爾頓姬小蜂的分子鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用蟲樣為廈門檢驗(yàn)檢疫局從臺(tái)灣蓮霧上截獲的米爾頓姬小蜂成蟲。標(biāo)本浸泡在無水乙醇中，－70℃保存。取米爾頓姬小蜂成蟲5頭于雙蒸水中漂洗，用吸水紙吸干備用。

1.2 主要生化試劑和儀器

基因組DNA提取試劑盒Universal Genomic DNA Extraction Kit、dNTP Mixture(2.5 mmol·L－1)購自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司;Dream TaqTMDNA Polymerase(5 U·μL－1)、10 × Dream TaqTMBuffer(含 20 mmol·L－1MgCl2)購自 Fermentas公司;100 bp DNA Ladder購自天根生化科技(北京)有限公司;PCR引物合成、克隆及測序委托上海生工生物工程公司完成;PCR儀為ABI公司的Applied Biosystems Thermal Cycler Veriti 96 Well。

1.3 總DNA的提取

基因組DNA提取參照試劑盒說明書(TaKaRa，Kit Ver.3.0)的方法。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳

16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增引物參考Szalanski et al.(2008)，上 游 引 物 為 LR-J-13007(5'-TTACGCTGTTATCCCTAA-3')，下游引物為LR-N-13398(5'-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3');COⅠ基因序列的擴(kuò)增引物參考Kolesik et al.(2009)，上游引物為COⅠs(5'-GGATCACCTGATATAGCATTCCC-3')，下游引物為COⅠa(5'-CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3')。

PCR反應(yīng)的總體積為50 μL，其中包括10×Dream TaqTMBuffer(含20 mmol·L－1MgCl2)5 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L－1)4 μL，上、下游引物(10 μmol·L－1)各 2 μL，Dream TaqTMDNA Polymerase(5 U·μL－1)0.25 μL，模板 DNA 4 μL，加滅菌雙蒸水至終體積。

PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3 min;94℃變性45 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。

1.5 克隆測序與序列分析

將PCR產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行克隆及測序。將獲得的DNA序列通過NCBI進(jìn)行BLAST相似性檢索，經(jīng)人工核對(duì)后確認(rèn)所得的序列片段，然后用DNAMAN和DNACLUB軟件對(duì)序列進(jìn)行剪裁與分析。

從GenBank上下載姬小蜂科的Chrysocharis nautilus(Walker)(GenBank登錄號(hào):HM573784)、C.eurynota Graham(GenBank登錄號(hào):HM573749)，蚜小蜂科的Encarsia berlesei(Howard)(GenBank登錄號(hào):GQ922199)，赤眼蜂科的Trichogramma nmwanzai Schulten(GenBank 登錄號(hào):DQ177920)、T.brasiliensis Ashmead(GenBank登錄號(hào):DQ177919)，金小蜂科的 Pteromalus sp.(GenBank登錄號(hào):HM574095)、NasonialongicornisDarling(GenBank登錄號(hào):GQ336371)的序列進(jìn)行比較，并采用DNAMAN上的Maximum Likelihood方法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 米爾頓姬小蜂16S rRNA和COⅠ PCR擴(kuò)增

利用2對(duì)通用引物對(duì)米爾頓姬小蜂進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物L(fēng)R-J-13007/LR-N-13398擴(kuò)增到16S rRNA約420 bp的條帶;引物COⅠs/COⅠa擴(kuò)增到COⅠ基因約490 bp的條帶(圖1)。

2.2 序列分析

2.2.1 米爾頓姬小蜂16S rRNA序列分析 克隆測序結(jié)果表明，米爾頓姬小蜂16S rRNA基因序列為426 bp(圖2)。同源性比較發(fā)現(xiàn)，該序列與數(shù)據(jù)庫中部分物種的序列有很高的同源性，因而確定克隆片段為16S rRNA基因部分序列。A、T、C、G平均含量分別為 175 bp(41.10%)、182 bp(42.70%)、39 bp(9.20%)、30 bp(7.00%)，且 A+T 含量(83.80%)大于 G+C 含量(16.20%)。

圖1 米爾頓姬小蜂16S rRNA和COⅠ基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of 16S rRNA and COⅠgenes in A.miltoni

2.2.2 米爾頓姬小蜂COⅠ序列分析 克隆測序結(jié)果表明，米爾頓姬小蜂 COⅠ基因序列為488 bp(圖3)。同源性比較發(fā)現(xiàn)，該序列與數(shù)據(jù)庫中部分物種的序列有很高的同源性，因而確定克隆片段為COⅠ基因部分序列。A、T、C、G平均含量分別為144 bp(29.51%)、211 bp(43.24%)、70 bp(14.34%)、63 bp(12.91%)，且 A+T 含量(72.75%)大于 G+C 含量(27.25%)。

2.2.3 基于COⅠ部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 根據(jù)COⅠ部分序列，利用DNAMAN的Maximum Likelihood方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4。米爾頓姬小蜂與蚜小蜂科的E.berlesei親緣關(guān)系最近，與姬小蜂科的C.nautius、C.eurynota親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。而按照形態(tài)學(xué)分類，米爾頓姬小蜂應(yīng)與后者親緣關(guān)系較近。這可能與米爾頓姬小蜂是植食性小蜂，而其他種類是寄生蜂有關(guān)。

圖2 米爾頓姬小蜂16S rRNA基因部分序列Fig.2 16S rRNA partial sequences in A.miltoni

圖3 米爾頓姬小蜂COⅠ基因部分序列Fig.3 COⅠ partial sequences in A.miltoni

3 結(jié)論與討論

本研究測定了米爾頓姬小蜂線粒體16S rRNA和COⅠ基因的部分序列，并分析了相應(yīng)序列的堿基組成特征。結(jié)果表明，其16S rRNA和COⅠ基因的A+T含量分別為83.80%和72.75%，均明顯高于C+G含量。該結(jié)果與其他昆蟲的16S rRNA和COⅠ基因研究結(jié)果(譚宏偉等，2009;趙惠玲等，2010;鄭福山等，2007)相符，即存在較強(qiáng)的A+T偏好性，這與昆蟲線粒體基因的堿基組成特征基本一致。

根據(jù)COⅠ部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹表明，米爾頓姬小蜂與蚜小蜂科的E.berlesei親緣關(guān)系最近，與姬小蜂科的 C.nautius、C.eurynota 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

本研究獲得了米爾頓姬小蜂線粒體16S rDNA和COⅠ基因的部分序列，為今后米爾頓姬小蜂的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究等奠定了基礎(chǔ)?；贑OⅠ基因的條碼技術(shù)已廣泛應(yīng)用于昆蟲的分子鑒定，因此，設(shè)計(jì)米爾頓姬小蜂特異引物進(jìn)行分子鑒定是下一步的工作重點(diǎn)。此外，米爾頓姬小蜂已入侵我國臺(tái)灣地區(qū)，隨著臺(tái)灣水果進(jìn)口量的不斷增多，我國大陸也存在米爾頓姬小蜂大量入侵的風(fēng)險(xiǎn)，因此應(yīng)引起有關(guān)部門的高度重視。

竇向梅，肖暉，黃大衛(wèi).2005.基因序列在小蜂總科分子系統(tǒng)發(fā)育研究中的應(yīng)用.動(dòng)物分類學(xué)報(bào)，30(1):29－34.

黃華平，楊臘英，王國芬.2006.rDNA和mtDNA在昆蟲系統(tǒng)發(fā)育與區(qū)系研究中的應(yīng)用.華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，12(4):45－49.

黃蓬英，林玲玲，葉正青，徐梅，吳媛.2008.臺(tái)灣蓮霧上截獲的米爾頓姬小蜂.植物檢疫，22(3):178－179.

龍健，龐虹.2003.瓢蟲的16S rDNA序列擴(kuò)增.貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，21(2):52－54.

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譚宏偉，董霞，和紹禹.2009.云南省東方蜜蜂線粒體16S rRNA基因的擴(kuò)增及序列分析.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，24(3):403－407.

趙惠玲，張虎芳，楊慧妮.2010.蝽亞科部分昆蟲 mtDNA 16S rRNA序列多態(tài)性分析(半翅目:蝽科).太原師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，9(4):134－138.

鄭福山，杜予州，王志杰，王莉萍.2007.基于線粒體COⅠ基因序列的小螢葉甲屬部分種類分子系統(tǒng)學(xué)研究(鞘翅目:葉甲科:螢葉甲亞科).昆蟲學(xué)報(bào)，50(5):501－507.

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