連玉新，張東杰，王穎

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

大豆分離蛋白是一種重要的植物蛋白產(chǎn)品，資源豐富，品質(zhì)優(yōu)良，是大豆制品中蛋白質(zhì)含量最高、應(yīng)用面最廣的高附加值產(chǎn)品[1-2]。大豆分離蛋白除具有許多重要功能性質(zhì)，是一種常用的食品添加劑，在食品中具有廣泛應(yīng)用[3]。蛋白質(zhì)功能性質(zhì)與應(yīng)用關(guān)系密切，是開發(fā)和利用蛋白質(zhì)資源的重要依據(jù)[4]。

大豆蛋白結(jié)構(gòu)改造及進(jìn)一步提高功能性質(zhì)一直是國內(nèi)外研究熱點(diǎn)[5]，酶法改性[6-8]是大豆分離蛋白常用的改性技術(shù)。本試驗(yàn)以大豆分離蛋白為原料，利用中性蛋白酶對其進(jìn)行改性，采用響應(yīng)面分析法對改性后大豆分離蛋白乳化性條件進(jìn)行研究，從而確定最優(yōu)的工藝條件。蛋白質(zhì)經(jīng)改性后，其功能特性可得到顯著地提高，一方面可以拓寬蛋白質(zhì)的應(yīng)用領(lǐng)域，另一方面可以作為一些昂貴原材料的替代品，因此在食品工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆分離蛋白：（水分含量為6.47%，灰分為4.385%，蛋白質(zhì)含量為74.57%，脂肪含量為0.90%）大慶日月星有限公司；中性蛋白酶：本實(shí)驗(yàn)室自制；NaOH：中國醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑廠。

AR2140型分析天平（梅特勒-托利多（上海）有限公司）；85-2A控溫磁力攪拌器（常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所）；PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程[9-12]

將大豆分離蛋白溶解于水中形成一定底物濃度的水分散液，維持在90℃下加熱攪拌10 min。冷卻至酶解溫度，加入恒溫至某一定溫度的水浴鍋中，恒溫攪拌30 min，調(diào)節(jié)pH至規(guī)定值，加入一定量的蛋白酶，緩慢攪拌反應(yīng)若干小時。水解結(jié)束后，酶解液在100℃維持10 min滅酶，裝瓶標(biāo)記冷藏，備用。

1.2.2 乳化性的測定[13-14]

取90 mL0.2%（w/v）待測樣品蛋白溶液（樣品蛋白溶解于0.2 mol·L-1pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液中），加入30 mL大豆色拉油，10000 r·min-1均質(zhì)1 min以形成乳化液，在均質(zhì)后0 min時從底部吸取樣品，用 0.1%（w/v）的 SDS（pH 7.0）稀釋 50 倍，測定在500 nm（OD500）處測定吸光值（以SDS溶液為空白），以均質(zhì)后0 min時的吸光值表示乳化活性（EA）。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

在大豆分離蛋白酶解過程中，影響其乳化活性的主要因素有反應(yīng)pH，大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)，酶用量，溫度和反應(yīng)時間。在響應(yīng)面分析前，先做單因素試驗(yàn)，選取試驗(yàn)因素與水平。pH：5、6、7、8 和 9；大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、5%、6%、7%、8%；酶用量2000、4000、6000、8000、10000 U·mL-1；溫度 40、45、50、55、60 ℃ ， 反 應(yīng) 時 間 60、90、120、150 和180 min，確定最佳的酶解條件。

1.2.4 響應(yīng)面法對酶解工藝優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計原理，以乳化活性為響應(yīng)值，設(shè)計五因素五水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，因素水平編碼見表1。數(shù)據(jù)用SAS 8.2程序分析確定最優(yōu)酶解反應(yīng)工藝參數(shù)。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and their coded levels in central composite table

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 pH對大豆分離蛋白乳化性的影響

pH對大豆分離蛋白乳化性的影響如圖1所示。pH為7時大豆分離蛋白乳化活性最高。這是由于酶是一種特殊的蛋白質(zhì)分子，反應(yīng)的pH會影響其分子構(gòu)象和其分子及底物分子的解離狀態(tài)，進(jìn)而影響酶活和反應(yīng)速度，過高或過低的pH均對反應(yīng)不利。

2.1.2 大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對大豆分離蛋白乳化性的影響

由圖2可知，在大豆分離蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，酶解后的大豆分離蛋白的乳化活性為1.391。其原因可能是:當(dāng)大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加時，肽的分子數(shù)也增加，疏水基團(tuán)暴露，增加了蛋白質(zhì)的疏水部分，有利于膠束的形成，并且端基增加，電荷數(shù)增加，乳化性增加；當(dāng)端基的數(shù)目增加到一定的程度，電荷繼續(xù)增大，親水性也增加到一定程度，吸附油滴的能力降低，乳化性又降低[15]。

圖1 pH對大豆分離蛋白乳化活性的影響Fig.1 The effect of t value of pH on emulsifying properties

圖2 大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對其乳化活性的影響Fig.2 Effect of content of soybean protein isolated on emulsifying properties

2.1.3 酶用量對大豆分離蛋白乳化性的影響

圖3 酶用量對大豆分離蛋白乳化活性的影響Fig.3 Effect of amount of enzyme on emulsifying properties

由圖3可知以看出，大豆分離蛋白乳化活性在最初隨酶用量的增加而增加，當(dāng)酶用量超過6000 U·mL-1時，乳化活性有下降的趨勢。其原因可能為：酶解時,大豆分離蛋白分子鏈長被縮短了，暴露了分子內(nèi)的疏水基團(tuán)，蛋白分子的表面疏水性提高了，使乳化時蛋白分子能更快地擴(kuò)散到油水界面處，同時也加強(qiáng)了蛋白質(zhì)在油水界面上的定位，形成乳液微粒直徑小[16]。

2.1.4 反應(yīng)溫度對大豆分離蛋白乳化性的影響

由圖4可知，在50℃時大豆分離蛋白的乳化活性最高。這是由于溫度一方面可以加快酶解速率，另一方面酶失活速度隨著溫度的升高加快。

2.1.5 反應(yīng)時間對大豆分離蛋白乳化性的影響

由圖5可看出，隨著反應(yīng)時間的延長，大豆分離蛋白的乳化活性呈現(xiàn)逐步上升趨勢，在反應(yīng)時間為120 min之前增幅較大。原因可能是隨著反應(yīng)時間的延長，酶與底物的契合逐漸增大，進(jìn)而增加酶解效率，增大的反應(yīng)后大豆分離蛋白的乳化活性。由于反應(yīng)120 min后乳化活性變化不大，并且酶促反應(yīng)時間過久水解產(chǎn)物中會出現(xiàn)帶有苦味的肽，所以綜合考慮選取反應(yīng)時間為120 min。

圖4 反應(yīng)溫度對大豆分離蛋白乳化活性的影響Fig.4 Effectofreactiontemperatureonemulsifyingproperties

圖5 反應(yīng)時間對大豆分離蛋白乳化活性的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on emulsifying properties

2.2 五元二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計優(yōu)化酶解條件

試驗(yàn)結(jié)果（如表2）通過SAS 8.2數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行回歸分析，由表3可知二次回歸方程為：

決該定系數(shù)R2=0.9953，由表3和表4所示，二次回歸模型的F值為158.469，其P＜0.01；而失擬項(xiàng)的P＞0.05，說明該模型的擬和效果良好。由表4可知，一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)P＜0.01，說明各個因素對乳化活性有極其顯著的影響。

表2 中心組合試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design and corresponding results

表3 回歸方程系數(shù)t檢驗(yàn)方差分析Table 3 t-test significance of each coefficient in the established regression model

續(xù)表3 回歸方程系數(shù)t檢驗(yàn)方差分析Continued Table 3 t-test significance of each coefficient in the established regression model

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the established regression model

為了確定最佳點(diǎn)的值，采用SAS軟件的RSREG程序?qū)υ囼?yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，以得酶法改性大豆分離蛋白的最佳工藝條件，經(jīng)典型性分析得出最佳酶解條件為：pH為7.1、大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.6%、酶用量為4919.241 U·mL-1反應(yīng)溫度為50.9℃、反應(yīng)時間為117.3 min。該條件下，改性大豆分離蛋白的乳化活性的預(yù)測值為1.391。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)試驗(yàn)的可靠性，采用上述最佳反應(yīng)條件進(jìn)行酶法改性大豆分離蛋白試驗(yàn)，同時考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳條件修正為pH為7.1、大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.6%、酶用量為5000 U·mL-1反應(yīng)溫度為51℃、反應(yīng)時間為117 min，經(jīng)過5次重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際得到的改性大豆分離蛋白乳化活性的平均值為1.390，與理論預(yù)測值1.391的相對誤差小于5%，說明該方程與實(shí)際情況擬合良好，響應(yīng)面分析所得到的優(yōu)化模型是可靠的，表明該數(shù)學(xué)模型對優(yōu)化酶改性大豆分離蛋白工藝條件是可行的，具有實(shí)用價值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計，以pH、大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶用量、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間為試驗(yàn)因素，以大豆分離蛋白乳化活性為指標(biāo)，得到大豆分離蛋白乳化活性的數(shù)學(xué)回歸模型。通過回歸模型分析可知pH、酶用量和大豆蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)對改性后大豆分離蛋白乳化活性的影響極顯著的。同時，得到大豆分離蛋白的最佳改性工藝參數(shù)為：pH為7.1、大豆分離蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.6%、酶用量為5000 U·mL-1、反應(yīng)溫度為51℃、反應(yīng)時間為117 min，該條件下得到改性后大豆分離蛋白的乳化活性為1.390。

隨著研究課題的深入，酶解大豆分離蛋白的過程中有許多工作需要進(jìn)一步完善。對于中性蛋白酶酶解大豆分離蛋白的其他功能性質(zhì)，蛋白各組成部分在酶解過程中對功能性質(zhì)的影響及其生理活性組分的研究，大豆蛋白在食品工業(yè)中其他方面的應(yīng)用的研究有待開展。

［1］石彥國.大豆制品工藝學(xué)［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，2005.

［2］顧振宇，江美都，付道才，等.大豆分離蛋白乳化性的研究［J］.中國糧油學(xué)報，2000，15（3）:32-34.

［3］逯昕.酶改性制備專用大豆分離蛋白的研究［D］.江南大學(xué)碩士生論文，2008.

［4］李玉珍，肖懷秋.蛋白酶酶解水解度對起泡性和乳化性的影響研究［J］.油脂開發(fā)，2009，17（6）：21-22.

［5］劉瑾.酶法改善大豆分離蛋白的起泡性和乳化性的研究［D］.江南大學(xué)碩士生論文，2008.

［6］Dinkar Danyam，Arum Kilara.Enhancing the functionality of food proteins by enzymaticmodification ［J］.Trends in Food Science&Technology，1996，7（4）：120-125.

［7］Amro B.Hanssan，Gammaa A，Osman，et al.Effect of chymotrypsin，digestion followed by polysaccharide conjugation or transglutaminase treatment on functional properties of millet proteins［J］.Food Chemistry，2007，12（1）：257-262.

［8］Raija Lantto， Paula Plathin et al. Effects of transglutaminase，tyrosinase and freeze-dried apple powder on gel forming and structure of pork meat［J］.LWT，2006，39：1117-1124.

［9］肖凱軍，曾慶孝，高孔榮.大豆分離蛋白的酶法改性─大豆多肽的制備及其在老年人奶粉中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，1995，16（9）：30-33.

［10］劉艷秋，陳光，孫旸.Protamex復(fù)合蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究［J］.食品科學(xué)，2005，26（6）：155-158.

［11］班玉鳳，朱海峰，孫明珠.Alcalase水解大豆蛋白制備大豆蛋白寡肽的研究［J］. 現(xiàn)代食品科技，2007，23（11）：51-53.

［12］鐘振聲，陳鈺，文錫蓮.木瓜蛋白酶與中性蛋白酶水解大豆分離蛋白的研究［J］. 現(xiàn)代食品科技，2009，25（3）：1039-1041.

［13］PearceK N，KinsellaJE.Emulsifyingpropertiesof protein：valuation of turbidimetric technique［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1978，26：716-723.

［14］Xian-Sheng Wang,Chuan-He Tang,Bian-Sheng Li etc.Effects of high -pressure treatment on some physicochemical and functional properties of soy protein isolates［J］.Food Hydrocolloids，2008，6（4）：560-567.

［15］肖凱軍，曾慶孝，高孔榮.酶解大豆分離蛋白特性研究［J］.廣州食品科技，1995，11（2）：5-10.

［16］Nakai s.Stureture-relationship off ood proteins with and emphasis on the importance of protein hydrophobieity［J］.Agri.Food Chem.，1983，31（4）：676-683.