羅 琴 林宜昆 王志紅 謝啟明

(1.楚雄師范學院化學與生命科學系，云南 楚雄 675000;2.德宏師范高等?？茖W校理工系，云南 德宏 678400)

多糖類化合物是一種免疫調(diào)節(jié)劑，參與細胞生命現(xiàn)象的調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn)100多種中藥中的多糖類化合物具有免疫促進作用，這類多糖沒有細胞毒性，而藥物質(zhì)量通過化學手段容易控制，已經(jīng)成為新藥的發(fā)展方向之一［1］。

近年來對蕨類植物進行分析研究，發(fā)現(xiàn)其具有抗微生物和抗腫瘤活性等，但有效成分的分離提取工藝尚需完善。而藥用蕨類植物多糖復合物具有多種生理和藥理活性，如抗腫瘤、免疫促進、抗凝血、抗補體、抗?jié)?、抗病毒和降血糖等，其功能作用限于細胞表面，具有高效低毒的特性?、3］。

二型鱗毛蕨 (Dryopteris cochleata(Buch.－Ham.ex D.Don)C.Chr.)國內(nèi)主要分布于四川、貴州、云南等地，屬鱗毛蕨屬鱗毛蕨科［4］。目前，對二型鱗毛蕨化學成分的研究報到較少，二型鱗毛蕨多糖提取及測定未見報道，本論文通過二型鱗毛蕨多糖提取、工藝優(yōu)化及二型鱗毛蕨多糖含量測定進行研究，為二型鱗毛蕨的開發(fā)利用提供參考。

1.材料與儀器

1.1 材料

二型鱗毛蕨全株，采自云南楚雄市紫溪山，經(jīng)楚雄師范學院徐成東教授鑒定。采集后迅速干燥后粉碎成干粉，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑

丙酮，甲醇，無水乙醇，苯酚，乙醚，濃硫酸，95%乙醇，葡萄糖標準品 (中國藥品生物制品檢定所)，以上試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾水。

葡萄糖貯備液配制:準確稱取經(jīng)60℃干燥至恒重葡萄糖0.1002g，定容至100ml，得濃度1.002mg/ml貯備液。用時稀釋成葡萄糖標準液。

苯酚溶液的配制:取苯酚100g，加入0.1g鋁片及0.05g碳酸鈉，加熱蒸餾，收集182℃餾分6.0g，加蒸餾水100ml溶解，即得6%苯酚溶液，置棕色瓶備用。

1.3 儀器

722型光柵分光光度計 (山東高密彩虹分析儀器公司);索氏提取器;HH－S2S恒溫水浴鍋 (金壇市大地自動化儀器廠);EX124電子天平 (奧豪斯儀器上海有限公司);9FZ－15型機械粉碎機。

2.實驗部分

2.1 多糖的提取工藝及定性鑒定［4—6］

2.1.1 多糖提取工藝

二型鱗毛蕨→洗凈→干燥→粉碎→熱水浸提→濃縮→濃縮液→醇析→過濾→洗滌→干燥→二型鱗毛蕨多糖。

2.1.2 多糖定性鑒定

(1)苯酚－硫酸法:取少量提取的多糖，滴加加體積比為1∶5的苯酚－硫酸溶液，觀察顏色。(2)蒽酮－硫酸法:取少量提取的多糖，滴加加體積比為1∶5的蒽酮－硫酸溶液，觀察顏色。

2.2 粗多糖提取工藝優(yōu)化［7］

2.2.1 提取溫度的選擇

分別稱取10g二型鱗毛蕨樣品5份，置于錐形瓶中，按料液比1∶20(g∶ml)加入蒸餾水，分別在不同溫度 (50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)的水浴鍋中加熱提取2h，提取2次合并提取液，提取濃縮至40ml，加60.0ml無水乙醇，靜置24h，過濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，揮發(fā)溶劑至干得粗多糖，干燥恒重后稱量粗多糖質(zhì)量，平行測定3次取平均值。

2.2.2 料液比的選擇

分別稱取10g二型鱗毛蕨樣品5份，置于錐形瓶中，分別按料液比 (g∶ml)1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40加入蒸餾水，在80℃水浴中提取2h，提取2次合并提取液，提取液濃縮至40ml，加60.0ml無水乙醇，靜置24h，過濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，揮發(fā)溶劑至干得粗多糖，干燥恒重后稱量粗多糖質(zhì)量，平行測定3次取平均值。

2.2.3 提取時間的選擇

分別稱取10g二型鱗毛蕨樣品5份，置于錐形瓶中，按料液比1∶30(g∶ml)加入蒸餾水，在80℃水浴中分別提取0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h，提取2次合并提取液，提取液濃縮至40ml，加80.0ml無水乙醇，靜置24h，過濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，揮發(fā)溶劑至干得粗多糖，干燥恒重后稱量粗多糖質(zhì)量，平行測定3次取平均值。

2.2.4 醇沉濃度的選擇

分別稱取10g二型鱗毛蕨樣品5份，置于錐形瓶中，按料液比1∶30加入蒸餾水，在80℃水浴中提取2h，提取2次合并提取液，提取液濃縮至40ml，分別加60%、70%、80%、90%乙醇、無水乙醇，靜置24h，過濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，揮發(fā)溶劑至干得粗多糖，干燥恒重后稱量粗多糖質(zhì)量，平行測定3次取平均值。

2.2.5 醇沉時間的選擇

分別稱取10g二型鱗毛蕨樣品5份，置于錐形瓶中，按料液比1∶30加入蒸餾水，在80℃水浴中提取2h，提取2次合并提取液，提取液濃縮至40ml，用80.0ml無水乙醇分別沉淀6h、12h、18h、24h、30h、，過濾，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，揮發(fā)溶劑至干得粗多糖，干燥恒重后稱量粗多糖質(zhì)量，平行測定3次取平均值。

2.3 多糖含量測定［8］

2.3.1 繪制標準曲線

分別吸取不同濃度的標準葡萄糖溶液2.00ml置比色管中，加6%苯酚溶液1.00ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.00ml，搖勻，置于冷水中放置15min，以試劑空白溶液為參比液，于490nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線。

2.3.2 換算因子測定

準確稱取干燥至恒重的二型鱗毛蕨多糖三份，置于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，再分別吸取1.00ml于50ml容量瓶中進行稀釋，然后吸取2.00ml稀釋溶液于比色管中，再分別加入6%苯酚溶液1.00ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.00ml，搖勻，置于冷水浴中放置15min。以試劑空白為參比，于490nm波長處測定吸光度，求換算因子f。

2.3.3 多糖測定

準確稱取一定量二型鱗毛蕨，置于索式提取器中，加入80.0ml氯仿和20.0ml甲醇，回流虹吸4次。脫去植物脂質(zhì)后，加入300.0ml蒸餾水，于80℃水浴中提取2h，提取2次后合并提取液，濃縮至60ml。離心后取清液加入8.0ml氯仿和2.0ml正丁醇，萃取除去蛋白質(zhì)和頑固脂質(zhì) (3次)后轉入100ml容量瓶中，用蒸餾水定容。吸取1.00ml于50ml容量瓶中進行稀釋，然后吸取2.00ml稀釋溶液于比色管中，再分別加入6%苯酚溶液1.00ml，搖勻，迅速加入濃硫酸5.00ml，搖勻，置于冷水浴中放置15min。以試劑空白為參比，于490nm波長處測定吸光度，對照標準曲線，計算二型鱗毛蕨中多糖的含量。

3.結果與分析

3.1 定性檢測結果

表1 多糖定性試驗結果

定性鑒定結果表明，提取物為多糖化合物。

3.2 提取溫度確定

根據(jù)2.2.2的方法，結果如圖3—1所示。

溫度控制在80℃時，多糖產(chǎn)率最高。在50～80℃之間，多糖產(chǎn)率隨著溫度的升高而增加，而在80～90℃之間，多糖產(chǎn)率逐漸平穩(wěn)，因此溫度宜控制在80℃。

圖3 —1 多糖提取溫度選擇

圖3 —2 多糖提取料液比選擇

3.3 料液比的確定

根據(jù)2.2.2的方法，結果如圖3—2所示。料液比在1∶10—1∶30之間時，隨著溶劑的增加多糖溶解量增大，但當溶劑量增加到1∶30時多糖已經(jīng)基本溶出完全，所以再加大溶劑的量多糖的產(chǎn)率增加不明顯.所以本試驗料液比選擇為1∶30。

3.4 提取時間的確定

根據(jù)2.2.3的方法，結果如圖3—3所示。

圖3 —3 多糖提取時間確定

圖3 —4 醇沉濃度的確定

在0.5h—2h時隨著時間的增加，多糖的產(chǎn)率增加較大，時間超過2h后，多糖在溶劑中已經(jīng)溶解完全，多糖的產(chǎn)率隨時間增大不再改變，因此提取時間以2h為佳。

3.5 醇沉濃度的確定

根據(jù)2.2.4的方法，結果如圖3—4所示。隨著乙醇濃度的增大，多糖產(chǎn)率在增加，且考慮到乙醇較易回收，所以本試驗選擇無水乙醇來沉淀多糖進行實驗。

3.6 醇沉時間的確定

根據(jù)2.2.4的方法，結果如圖3—5所示。

圖3 —5 醇沉時間的確定

圖3 —6多糖測定標準曲線

由圖3—5可知:隨著醇沉時間增大，多糖產(chǎn)率增加，隨著醇沉時間增大，二型鱗毛蕨粗多糖產(chǎn)率增加，多糖產(chǎn)率幾乎穩(wěn)定不變，為此本實驗較佳醇沉時間為24h。

3.7 繪制標準曲線

根據(jù)2.3.1的方法，結果如3—6圖所示。根據(jù)標準曲線建立回歸方程為:

表明在20～10 ug/ml范圍內(nèi)，吸光度與多糖濃度呈良好的線性關系。

3.8 多糖含量測定

3.8.1 換算因子確定

根據(jù)2.3.2方法及公式:f=W×106/(C×D)。式中W為二型鱗毛蕨多糖質(zhì)量 (g)，C為多糖的濃度，D為多糖的稀釋倍數(shù)，算出多糖的換算因子如下表2所示。

表2 二型鱗毛蕨多糖的換算因子

3.8.2 多糖含量測定

根據(jù)2.2.6方法及公式:多糖含量=(C×D×f)/(W×106)，式中W為二型鱗毛蕨的質(zhì)量 (g)，C為多糖溶液中葡萄糖的濃度 (ug/ml)，D為多糖的稀釋倍數(shù)，f為換算因子。算出多糖提取率如下表3所示。

表3 二型鱗毛蕨多糖含量測定

4.結論

1.多糖提取工藝中，物料比、提取時間、提取溫度、沉淀劑乙醇濃度、沉淀時間對實驗結果均有一定影響。實驗表明，二型鱗毛蕨多糖提取較佳工藝是:經(jīng)過干燥 (60℃)粉碎的二型鱗毛蕨樣品按料液比為1∶30加入蒸餾水，在80℃水浴中浸提2h，水提液濃縮至20ml，加入無水乙醇沉淀24h，過濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌、干燥得到淺黃色二型鱗毛蕨多糖，多糖提取率為二型鱗毛蕨全株干重的2.51%。

2.用苯酚－硫酸比色法對二型鱗毛蕨中多糖含量測定，測得二型鱗毛蕨中多糖含量為2.64%。多糖提取率比測定多糖含量低的原因是，多糖在提取過程中因溶解、洗滌等因素而損失。二型鱗毛蕨多糖的結構及活性有待進一步研究。

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