林 力，鄧 碧，壽 鑄，梁 佳，陳鴻雁△

（1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科 400016；2.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院麻醉科 401120）

硫鏈絲菌肽（thiostrepton，TST）是一種噻唑類抗生素，可從多株青鏈霉菌中分離獲得［1］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)TST可通過靶向作用于Forkhead box protein M1（Foxm1）轉錄因子抑制腫瘤細胞增殖，并且對其他轉錄因子的轉錄活性無影響；此外，用此類抗生素處理不同來源的人腫瘤細胞株，可在下調Foxml基因表達的同時誘導細胞凋亡［2］。

Foxm1是一種上調細胞增殖的轉錄因子，屬叉頭框家族（Fox家族）。有研究表明，它與胚胎發(fā)育、再生、衰老和腫瘤發(fā)生等許多病理生理過程密切相關［3］。本研究前期工作中發(fā)現(xiàn)Foxm1在鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）組織中高表達，與NPC的分期及轉移程度呈正相關。因此，本研究從細胞角度檢測Foxm1在鼻咽癌HNE－1細胞株中的表達；同時檢測TST對鼻咽癌HNE－1細胞株增殖抑制的作用及可能機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1腫瘤細胞系 人鼻咽癌HNE－1細胞株（購自中科院上海細胞所）。

1.1.2試劑與藥品 RPIM1640（Gibco公司），新生小牛血清（杭州四季青公司），四甲基偶氮唑鹽（MTT，上海華舜生物工程有限公司），二甲亞砜（DMSO，重慶醫(yī)藥股份有限公司），TST（Merck公司），免疫組化SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、山羊抗兔二抗（北京中杉公司），兔抗人Foxm1多克隆抗體（Santa Cruz公司），Western blot相關試劑（碧云天生物技術公司）。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將HNE－1細胞接種到含10%熱滅活小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內培養(yǎng)，細胞呈單層黏壁生長。傳代時用0.1%胰酶－0.02%EDTA溶液消化，臺盼藍拒染法計算成活細胞數(shù)。

1.2.2TST對HNE－1細胞體外抑制實驗 取對數(shù)生長期的HNE－1細胞，胰酶消化，離心，制成細胞懸液，調整細胞數(shù)為5×104/mL。取96孔培養(yǎng)板，每孔加入200μL細胞懸液，加入TST，使其終濃度分別為1、2、4、8、12、16μmol/L，每一濃度重復6孔，設試劑對照組及細胞對照組，置37℃、5%CO2孵箱內培養(yǎng)48h。離心后，小心去除上清液，每孔加無血清培養(yǎng)液200μL及5mg/mL MTT 20μL繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心，吸去上清液，每孔加200μL DMSO，置于振蕩器上振蕩10min，自動酶標儀上測出各孔吸光度值［D（490）］，檢測波長為490nm。上述實驗均重復3次，計算細胞生長抑制率。

1.2.3TST對HNE－1細胞周期變化的影響 分別將濃度為1、2μmol/L的TST處理細胞48h后，實驗設置對照組，收集HNE－1細胞，PBS洗滌2次。離心，去上清液，緩慢加入－20℃預冷的75%乙醇，固定1h。PBS洗滌2次，將等體積的細胞懸液和PI染液混合，4℃放置30min。將樣品放入流式細胞儀（FCM）的樣品室，以激發(fā)波長488nm測定，并用Modfit LT2.0軟件分析細胞周期分布。

1.2.4免疫細胞化學法測定不同濃度TST作用于HNE－1細胞48h后Foxm1的蛋白表達 分別將終濃度為1、2μmol/L的TST處理細胞48h，同時設細胞對照組和以PBS代替Foxm1一抗的陰性對照組。參照免疫組化SABC試劑盒說明書進行。

1.2.5Western blot檢測細胞Foxm1蛋白表達 將終濃度分別為1、2μmol/L的TST作用HNE－1細胞48h后，細胞裂解液提取胞漿蛋白，Bradford法測定含量后，取等質量的蛋白進行SDS－PAGE電泳分離，轉膜（220mA 2h）后封閉1h，加入兔抗人Foxm1、β－actin一抗37℃孵育。洗滌后加入羊抗兔二抗孵育2h，TBST液洗滌膜3次，加入ECL化學發(fā)光試劑，曝光，成像。用Quantity one分析軟件測定各條帶光密度值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料采用s表示，進行多組均數(shù)比較的單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1MTT法檢測TST對HNE－1細胞的生長抑制作用 通過MTT觀察到，TST對HNE－1細胞生長抑制作用明顯。經各濃度TST作用48h后，HNE－1細胞的生長抑制率分別在8.31%、17.46%、34.28%、58.68%、87.91%、99.05% （表 1）。由此計算出TST作用于 HNE－1細胞48h的IC50為4.015 μmol/L。根據本結果，本文后續(xù)實驗均選擇濃度為1、2μmol/L的TST藥物作用于HNE－1細胞。

表1 TST作用48h后對HNE－1細胞增殖抑制作用的影響（s）

表1 TST作用48h后對HNE－1細胞增殖抑制作用的影響（s）

組別 OD490 抑制率（%）

2.2TST對 HNE－1細胞周期變化的影響 用FCM檢測TST作用于HNE－1細胞48h細胞周期的變化顯示，經TST處理的兩組細胞的G0/G1期細胞百分率（68.49±3.16%）%、（72.31±2.43）%均高于對照組（53.91±5.13）%，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結果還顯示2μmol/L TST組G0/G1期百分率高于1μmol/L TST組（P＜0.05），見表2。

2.3免疫細胞化學法測定不同濃度TST作用于HNE－1細胞48h的Foxm1蛋白表達量 Foxm1在對照組細胞質內表達明顯，不同濃度TST作用于HNE－1細胞48h的Foxm1蛋白表達減少，并且TST濃度越大，F(xiàn)oxm1蛋白表達減少越明顯。利用分析測量圖像軟件Imagepro－Plus5.0進行半定量分析，各濃度TST組的平均光密度值（TST 1μmol/L組：0.207±0.008，TST 2μmol/L組：0.186±0.006）與對照組（0.224±0.008）比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見封3圖1。

表2 TST對HNE1細胞周期變化的影響（s，%）

表2 TST對HNE1細胞周期變化的影響（s，%）

a：P＜0.05，與空白對照組比較；b：P＜0.05，與 TST 1μmol/L組比較。

組別 G0～G1 S G2/M 53.01±5.13 26.66±1.04 20.33±1.03 TST 1μmol/L組 68.49±3.16a18.33±1.13a13.18±2.31a TST 2μmol/L組 72.31±2.43ab 14.18±1.21ab 13.51±2.52對照組ab

2.4Western blot檢測不同濃度 TST作用于 HNE－1細胞48h的Foxm1蛋白表達 作用48h后對照組和各濃度TST組均可見明顯的Foxm1蛋白表達，在經TST處理的細胞上表達尤其明顯。將各濃度TST組Foxm1/內參灰度比值（TST 1 μmol/L組：0.831±0.014，TST 2μmol/L組：0.758±0.026），與對照組（0.962±0.016）進行比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 Western blot檢測不同濃度TST作用于HNE－1細胞48h的Foxm1蛋白表達

3 討 論

鼻咽癌是中國南方常見的頭頸部惡性腫瘤之一，化療是目前晚期鼻咽癌的主要治療方案之一，但由于化療藥物毒副作用大，臨床應用受到限制［4］。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素協(xié)同作用的過程，包括病毒感染、致癌物作用、癌基因激活和抑癌基因失活、細胞凋亡和增殖調節(jié)失調等多個因素多個環(huán)節(jié)［5］。隨著腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中新的腫瘤分子機制的不斷闡明，全新的腫瘤治療策略應運而生。其中靶向治療是目前腫瘤治療的研究熱點［6］。

Foxm1基因是一種增殖特異性基因，與胚胎發(fā)育、衰老、再生和腫瘤等許多病理、生理過程關系密切［7］。目前，有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1在肝癌、基底細胞癌、乳腺癌 、肺癌等多種腫瘤中高表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［8－12］。Foxm1有望成為一種潛在的全新腫瘤治療靶點。另有報道，TST可特異性抑制乳腺癌細胞中Foxm1，而達到抑制腫瘤生長的作用［7］。

作者的前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxm1在人鼻咽癌組織中高表達，并與鼻咽癌的分期及轉移程度呈正相關。因此，本研究從細胞角度檢測Foxm1在鼻咽癌HNE－1細胞株中的表達；同時檢測TST對鼻咽癌HNE－1細胞株增殖抑制的作用及與Foxm1相關的可能機制，結果顯示：（1）TST對HNE－1有明顯的增殖抑制作用，并且隨濃度的增加，增殖抑制作用增強，這與Nicolaou等［13］報道TST對肺癌細胞株具有較強的增殖抑制作用相符。（2）在TST作用后的 HNE－1細胞中，G0/G1期細胞百分率增加，導致HNE－1細胞阻滯在G0/G1期，并且呈劑量依賴性，這與Koo等［2］報道TST阻滯乳腺癌細胞株于G0/G1期是相符的。（3）隨TST濃度的增加，F(xiàn)oxm1蛋白表達量的表達逐漸減少；TST對 HNE－1細胞的增殖抑制作用可能是通過抑制Foxm1蛋白表達實現(xiàn)的，這與Bhat等［14］報道相符。

綜上所述，TST對人鼻咽癌HNE－1細胞株具有較好的體外增殖抑制作用，其機制可能是通過抑制腫瘤細胞中Foxm1轉錄因子的蛋白表達實現(xiàn)的。本實驗可為Foxm1基因成為腫瘤治療的新靶點及其特異性抑制劑TST的臨床應用提供一定的實驗室基礎。

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