劉鼎闊，王立紅，徐大為，楊愛華，王建春，秦 操，張 勇＊

（1.鼎正動物藥業(yè)（天津）有限公司，天津 300402；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300402；3.天津市動物疫病預(yù)防與控制中心，天津 300402；4.新鄉(xiāng)市紅旗區(qū)職業(yè)高級中學(xué)，河南 新鄉(xiāng) 453200）

IFN－γ屬于Ⅱ型干擾素，又稱免疫干擾素，是在特定誘生劑的作用下由多種細(xì)胞產(chǎn)生的具有高度生物活性的可溶性糖蛋白，是一種重要的細(xì)胞因子[1]。IFN－γ在抵抗哺乳類和鳥類病原侵染中具有重要的作用，對腫瘤[2]、細(xì)菌[3]、病毒[4]以及寄生蟲[5]等具有多重抵抗作用。目前研究已證實雞IFN－γ對流感病毒、新城疫病毒[6]、馬立克病病毒[7－9]及雞勞氏肉瘤病毒[10]等具有較好的抑制作用，它不僅參與機(jī)體對病原侵害的保護(hù)性應(yīng)答，還可通過細(xì)胞的信號通路廣泛參與包括調(diào)節(jié)機(jī)體主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ（MHCⅡ）成熟、抗原遞呈等在內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)，是機(jī)體內(nèi)重要的免疫增強(qiáng)劑[11]。

雞的IFN－γ基因由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，其開放性閱讀框有495個堿基，編碼19個氨基酸的信號肽和145個氨基酸的成熟蛋白，其成熟蛋白大小約為18ku。本實驗室從依莎褐雞中克隆獲得 的 cIFN－γ （GenBank accession number：AY705909），并成功的利用大腸埃希菌表達(dá)出具有生物活性的雞IFN－γ[12]。但由于雞IFN－γ在大腸埃希菌中表達(dá)效率過高，其表達(dá)產(chǎn)物主要以無活性的包涵體形式存在，須對包涵體進(jìn)行變性、復(fù)性等后續(xù)處理工作，以獲得具有生物學(xué)效應(yīng)的重組表達(dá)產(chǎn)物。不同的重組蛋白的復(fù)性條件有非常大的差異，復(fù)性效率顯著不同，這些嚴(yán)重制約雞IFN－γ的工業(yè)化生產(chǎn)。因此，我們對蛋白質(zhì)復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，力求找到一種簡單、價格低廉、復(fù)性得率和效率較高的方法，為雞IFN－γ的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組雞γ干擾素（cIFN－γ）蛋白表達(dá)產(chǎn)物純化的重組雞γ干擾素由課題組制備[12]。

1.1.2 SPF雞胚 SPF雞胚購于北京梅利亞維通實驗動物技術(shù)有限公司，38℃孵化，控制濕度約60%。

1.1.3 雞新城疫病毒 （Newcastle disease virus，NDV） 新城疫病毒（CVCC，AV1611），購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，經(jīng)SPF雞胚尿囊接種，增殖一代，毒力為10－6CLD50／0.10mL。

1.2 方法

1.2.1 cIFN－γ復(fù)性條件的探索

1.2.1.1 利用緩沖液置換，以PBS進(jìn)行透析復(fù)性將純化得到的重組雞γ干擾素的濃度稀釋到100 μg／mL[13]，將其全部轉(zhuǎn)移入透析袋后，放在4℃預(yù)冷的透析液Ⅰ～Ⅲ （40mmol／L Tris－HCl，300 mmol／L NaCl，Urea濃度分別為6.0mol／L、4.5 mol／L和3.5mol／L，調(diào)pH8.0）中透析24h，每種透析液持續(xù)透析8h，每4h更換一次。轉(zhuǎn)移5mL至一新透析袋，放入透析液Ⅳ（PBS）中透析24h，間隔4h更換一次透析液，期間用磁力攪拌器溫和攪拌。復(fù)性完畢，取1mL樣品，4℃、10000r／min離心取上清液進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量和SDSPAGE電泳分析。

1.2.1.2 利用不同復(fù)性液進(jìn)行透析復(fù)性 參照1.

2.1.1 的方法，透析降低純化所得的重組雞γ干擾素中的變性劑濃度至3.5mol／L后，分別轉(zhuǎn)移至新透析袋至透析液Ⅳ（相應(yīng)的復(fù)性緩沖液，見表一）中透析復(fù)性24h。復(fù)性完畢，轉(zhuǎn)移至PBS中，透析除去殘留的變性劑。取最終復(fù)性完成的樣本1mL，4℃、10000r／min離心取上清液進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量和SDS－PAGE電泳分析。

表1 18種蛋白質(zhì)復(fù)性緩沖液配制表Tabel 1 Preparation of refolding buffer for 18proteins ／（mmol·L－1）

1.2.1.3 去污劑作用效果分析 將純化得到的重組雞γ干擾素的濃度稀釋到100μg／mL，分別將TritonX－100加入到透析液Ⅰ～Ⅲ處理前后的變性蛋白質(zhì)溶液中，4℃磁力攪拌器溫和攪動4h，再參照1.2.1.2的方法在復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性及分析。

1.2.1.4 疏水劑作用效果分析 參照1.2.1.3，將經(jīng)透析液Ⅰ～Ⅲ處理后加入TritonX－100的重組雞γ干擾素所得的樣品平均分成五份，向第1、2份樣品中加入β－CD，溫和攪動2h，將第1、3份樣品分別放在不添加PEG的復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性處理，將第2、4份樣品分別放在不添加任何疏水劑的復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性及分析，第5份樣本放在復(fù)性試液16中進(jìn)行復(fù)性。

1.2.2 重組雞γ干擾素復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性分析

1.2.2.1 細(xì)胞實驗分析cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性 本次試驗測定新城疫病毒（NDV）對雞胚成纖維細(xì)胞的毒力（TCID50）為10－6.123／0.1mL。取9日齡雞胚制備雞胚成纖維細(xì)胞[12]，待接種于96孔板的細(xì)胞生長致密后，選用在復(fù)性試液3、8、11和16中復(fù)性完成的蛋白，分別在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入不同劑 量 （5、10、20、40、80 、160、320ng／mL）的cIFN－γ；同時選用1.2.1.3中復(fù)性的兩份蛋白、1.2.1.4中復(fù)性的第1、3、5份蛋白，分別設(shè)置1、5、10、20、40、80 、160ng／mL共7個試驗組。待cIFN－γ處理細(xì)胞24h后，以100倍TCID50濃度，每孔20 μL的NDV感染細(xì)胞，設(shè)置空白對照組（無cIFN－γ和病毒）、陽性對照組（40ng／mL cIFN－γ）、陰性對照組（10－6濃度NDV），每組各6個平行。病毒感染作用1h后，Hank′s緩沖液洗棄各孔病毒，加入1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h，于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并以MTT法檢測細(xì)胞的存活率。

1.2.2.2 雞胚試驗分析cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性 本次試驗測定新城疫病毒（NDV）對雞胚的毒力（EID50）為10－6.079／0.1mL。在進(jìn)行雞胚攻毒前，選用在復(fù)性試液8和16中復(fù)性完成的蛋白使雞胚建立抗病毒狀態(tài)，每種蛋白設(shè)立0.5、1、2、4、10 μg／枚5個蛋白組和1個空白對照組，每組10枚，共計12組。24h后接種100EID50的NDV，逐日觀察雞胚死亡情況至孵出。

1.2.3 統(tǒng)計分析 采用SPSS統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物保護(hù)雞胚成纖維細(xì)胞及雞胚抗病毒活性進(jìn)行卡方檢驗，統(tǒng)計數(shù)據(jù)間差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 利用不同復(fù)性液對重組雞γ干擾素復(fù)性條件的摸索

試驗發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽是促進(jìn)cIFN－γ復(fù)性的關(guān)鍵因素，在蛋白得率排名前4的復(fù)性試液中均存在谷胱甘肽，最高得率為83.7%；而不含谷胱甘肽的復(fù)性試液最后的蛋白得率不超過40%（圖1）。

圖1 SDS－PAGE分析18種復(fù)性產(chǎn)物Fig.1 SDS－PAGE analysis of 18different refolding products

2.2 重組γ雞干擾素復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性分析

2.2.1 cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）抗病毒活性的影響 顯微觀察結(jié)果顯示，病毒對照組的細(xì)胞大量變圓脫落，并伴隨細(xì)胞融合現(xiàn)象，其OD值在各組中均是最低（圖2，圖3）。

復(fù)性試液中同時引入疏水劑有助于cIFN－γ的復(fù)性，能有效提高其復(fù)興效率，數(shù)據(jù)顯示，樣本中添加疏水劑與否，在完整的16號復(fù)性試液中復(fù)性的產(chǎn)物的生物學(xué)活性均優(yōu)于不完整的（剔除PEG）復(fù)性試液16的復(fù)性產(chǎn)物（圖4）。

圖2 16號復(fù)性液復(fù)性產(chǎn)物對雞胚成纖維細(xì)胞抗病毒活性的影響Fig.2 Effects of№16refloding liquid products on the antiviral activity of chick embryo fibroblast

圖3 4種復(fù)性試液中cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對CEF抗病毒活性的影響Fig.3 Effects of cIFN gamma refolding products of four kinds of refolding solution on CEF antiviral activity

圖4 去污劑及疏水劑對cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對CEF抗病毒活性的影響Fig.4 Effects of decontamination agent and a hydrophobic agent to cIFN gamma refolding products on CEF antiviral activity

2.2.2 cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對雞胚抗病毒活性的影響以雞胚的存活率對攻毒后的存活時間作曲線，分析發(fā)現(xiàn)，攻毒后48h，兩組空白組的雞胚全部死亡，而在兩種復(fù)性試液中復(fù)性的不同濃度的（IFN－γ）均表現(xiàn)出一定的保護(hù)雞胚抵御NDV的能力。在復(fù)性試液8復(fù)性的蛋白組中，攻毒后72h給與0.5、1、2 μg蛋白組的雞胚存活率均降至50%以下，120h后2μg蛋白組的雞胚存活率僅為20%，其余兩組雞胚的死亡率為100%；4μg與10μg蛋白組在攻毒后72h的雞胚存活率均為80%，120h后仍均有60%的雞胚存活直至孵出。在復(fù)性試液16中復(fù)性的cIFN－γ表現(xiàn)出相對較高的防護(hù)能力，攻毒72h后僅0.5μg蛋白組的雞胚存活率降至10%，其余各蛋白組雞胚的存活率均在60%以上；120h后0.5μg蛋白組雞胚全部死亡，1μg和2μg蛋白組的雞胚存活率分別為10%和50%；4μg與10μg蛋白組雞胚的最終孵出率分別達(dá)到70%和90%（圖5）。

圖5 cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物對雞胚抗病毒活性的影響Fig.5 Effects of cIFN gamma renatured products on the chick embryo antiviral activity

3 討論

在大腸埃希菌中許多外源蛋白的高水平表達(dá)最后都會形成包涵體，包涵體具有無定形、呈非水溶性、只溶于尿素等變性劑和不具有相應(yīng)的生物學(xué)活性等缺點。想要進(jìn)行蛋白的相關(guān)功能研究和獲得具有生物學(xué)活性的蛋白必須對包涵體進(jìn)行復(fù)性。透析除去變性劑是最常用和最廉價的蛋白復(fù)性方法，尤其適用于較大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，然而這種方法亦有其弊端，經(jīng)其復(fù)性后正確折疊的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量不穩(wěn)定，有時會很降低，更有些蛋白尤其是含有多對二硫鍵的蛋白質(zhì)基本上不能正確進(jìn)行折疊。因此，探索一種能使雞γ干擾素穩(wěn)定高效復(fù)性的方法，是其當(dāng)前面向市場和進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵。

本研究在獲得高效表達(dá)的cIFN－γ基礎(chǔ)上，通過對其本身性質(zhì)、蛋白質(zhì)濃度、復(fù)性液的pH、變性劑的起始濃度和去除速度、助溶劑、疏水劑、離子強(qiáng)度、去污劑和氧化還原電勢等進(jìn)行了分析，并進(jìn)行了大量復(fù)性條件的摸索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在cIFN－γ復(fù)性過程中，助溶劑、去污劑、疏水劑以及氧化還原電勢的效用最為顯著，其中助溶劑和疏水劑是保證復(fù)性得率的關(guān)鍵，而去污劑和氧化還原電勢直接關(guān)系到蛋白的復(fù)性效率。同時研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)性前利用去污劑預(yù)先處理變性蛋白質(zhì)能顯著提升復(fù)性效率，復(fù)性效率與蛋白質(zhì)的純度呈正相關(guān)，在變性蛋白質(zhì)中引入去污劑，有利于進(jìn)一步除去蛋白中殘留的宿主菌成分，后續(xù)的活性試驗證明，在相同的復(fù)性條件下，用去污劑預(yù)先處理的復(fù)性產(chǎn)物的有效濃度相對較低。在復(fù)性過程中，引入氧化還原電勢是雞γ干擾素成功復(fù)性的基礎(chǔ)，變性蛋白質(zhì)復(fù)性中常常存在二硫鍵搭配錯誤的問題，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚集沉淀[14]，氧化還原對GSSG－GSH可以糾正搭配錯誤的二硫鍵并催化其在正確位置上的形成，試驗證明，8種不含有谷胱甘肽的復(fù)性試液復(fù)性的蛋白均不具有保護(hù)細(xì)胞抵御病毒的能力。

純化的重組雞γ干擾素經(jīng)18種不同的復(fù)性試液透析后，均得到不同程度的復(fù)性。其中復(fù)性試液3、8、11和16在透析復(fù)性的過程中，幾乎沒有產(chǎn)生肉眼可見的沉淀，其復(fù)性產(chǎn)物的得率最高，復(fù)性完成后經(jīng)考馬斯亮藍(lán)定量分析發(fā)現(xiàn)，16后復(fù)性試液中復(fù)性的cIFN－γ得率可達(dá)83.7%。復(fù)性試液5、7、17和18中cIFN－γ的得率最低，在復(fù)性后期出現(xiàn)大量白色沉淀，其中18號復(fù)性試液組分相當(dāng)于生理鹽溶液，在其中復(fù)性的cIFN－γ幾乎全部沉淀析出。將復(fù)性試液中的不同成分及復(fù)性得率做logistic－regression分析表明，復(fù)性試液中助溶劑、去污劑、疏水劑以及谷胱甘肽的作用最為顯著。助溶劑在蛋白復(fù)性過程中可以通過破壞錯誤折疊中間體的穩(wěn)定性，從而達(dá)到提高蛋白的可溶性的目的，L－精氨酸和蔗糖都是常用助溶劑，在本試驗中，前者的助溶效果優(yōu)于后者。在cIFN－γ復(fù)性過程中去污劑TritonX－100的效用優(yōu)于Tween－20，在復(fù)性試液其他成分不變時，添加TritonX－100的蛋白得率為83.7%，明顯高于Tween－20的最高得率64.3%。選擇分別在復(fù)性開始前后往變性蛋白質(zhì)溶液中加入去污劑，對蛋白的復(fù)性得率沒有顯著影響。疏水劑可以阻止蛋白質(zhì)分子間相互碰撞，減少蛋白質(zhì)的聚集沉淀，PEG與β－CD是最常用的蛋白質(zhì)修飾劑，本試驗中兩者單獨使用的效用沒有顯著差異，兩者共用，協(xié)同作用顯著，擁有最高的蛋白得率。

選擇在變性的cIFN－γ中的變性劑濃度為8 mol／L和3.5mol／L左右時，向溶液中引入去污劑，對蛋白質(zhì)得率沒有顯著影響，但前者的復(fù)性產(chǎn)物的抗病毒活性優(yōu)于后者。復(fù)性試液組分中是否帶有疏水劑，能顯著影響復(fù)性產(chǎn)物的得率，試驗發(fā)現(xiàn)，變性的cIFN－γ中是否含有疏水劑對產(chǎn)物得率沒有顯著影響，但若復(fù)性試液中不含有疏水劑，80%以上的cIFN－γ將沉淀析出。

復(fù)性產(chǎn)物cIFN－γ對CEF細(xì)胞抗NDV保護(hù)作用的實驗結(jié)果表明，在四種復(fù)性液中復(fù)性的40 ng／mL以上的cIFN－γ對侵入NDV的CEF均具有明顯的免疫保護(hù)作用（p＜0.05）；復(fù)性試液16中復(fù)性的蛋白在10ng／mL時便能保護(hù)CEF抵御病毒的入侵，隨著濃度的升高，其保護(hù)能力迅速提升，當(dāng)濃度達(dá)到160ng／mL時，其保護(hù)的CEF幾乎不受病毒侵襲；8號復(fù)性試液中復(fù)性的cIFN－γ的抗病毒活性相對較弱，當(dāng)濃度達(dá)到320ng／mL時，其保護(hù)作用仍未達(dá)到最優(yōu)。各陰性對照組中細(xì)胞的存活率和空白對照組相當(dāng)，說明在離體狀態(tài)下各復(fù)性試液復(fù)性的蛋白對CEF細(xì)胞沒有毒害作用。

在考查去污劑及疏水劑對cIFN－γ復(fù)性產(chǎn)物保護(hù)雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）抗病毒活性的影響的試驗中，所采用的5種cIFN－γ的復(fù)性方法對其產(chǎn)物高濃度下的生物學(xué)活性沒有顯著影響。試驗發(fā)現(xiàn)，變性蛋白樣品中引入去污劑TritonX－100的時間點能顯著影響蛋白的復(fù)性效率，選擇在復(fù)性開始前用TritonX－100處理的復(fù)性產(chǎn)物的生物學(xué)活性在1 ng／mL時就具有對CEF的保護(hù)能力，其存活細(xì)胞的OD值顯著高于NDV對照組（P＜0.05），而選擇當(dāng)變性蛋白中變性劑濃度降到3.5mol／L左右再引入去污劑，該濃度下細(xì)胞存活率與NDV對照組差異不顯著（P＞0.05），當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到5ng／mL以上時，兩者保護(hù)的細(xì)胞的存活率均顯著高于各自的陰性對照組。在變性蛋白質(zhì)中引入疏水劑，能改善cIFN－γ的復(fù)性效率，結(jié)果顯示，在變性蛋白樣品中引入β－CD的復(fù)性產(chǎn)物，低濃度下對CEF的保護(hù)能力明顯優(yōu)于不添加疏水劑的復(fù)性產(chǎn)物。

透析復(fù)性是經(jīng)典的蛋白復(fù)性方法，具有批處理量大、操作簡單、成本低廉等優(yōu)勢，易于考察影響復(fù)性效率的諸因素，可以方便得出較優(yōu)的復(fù)性條件。本研究通過對雞γ干擾素復(fù)性條件進(jìn)行優(yōu)化，成功找到了一種復(fù)性得率和復(fù)性效率均較高的復(fù)性方法，并通過雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚試驗驗證其具有較高的生物學(xué)活性，證明了雞γ干擾素在病毒病的防治方面的廣闊的應(yīng)用前景，為新型抗病毒制劑的研制和干擾素的大批量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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